[发明专利]用于扩增核酸的方法和用于实施其的试剂盒

权利要求书

1.用于扩增核酸的方法，包括以下步骤：

a)将第一引物寡核苷酸与待扩增的核酸链的3'区段杂交，其中待扩增的核酸链包含靶序列，

其中第一引物寡核苷酸包含：

·第一引物寡核苷酸的3'区段中的第一引物区域，其可序列特异性结合待扩增的核酸链的链，

·第二区域，其直接或经由接头连接到第一引物寡核苷酸的第一引物区域的5'末端并且包含适合于结合激活物寡核苷酸并支持通过激活物寡核苷酸的链置换(步骤c)的多核苷酸尾，其中多核苷酸尾在选定的反应条件下基本上保持未通过聚合酶复制，

b)通过聚合酶延伸第一引物寡核苷酸以形成第一引物延伸产物，其包含与待扩增的核酸链(a)的靶序列互补的序列，

c)将激活物寡核苷酸与第一延伸引物寡核苷酸的第二区域的多核苷酸尾结合，其中所述激活物寡核苷酸包含：

·第一单链区域，其可与第一引物寡核苷酸的第二区域的多核苷酸尾结合，

·第二单链区域，其基本上是互补的并且可与第一引物寡核苷酸的第一区域结合，

·第三单链区域，其与第一引物延伸产物的已通过聚合酶合成的延伸产物的至少一区段基本上互补，

其中激活物寡核苷酸不作为用于第一引物寡核苷酸的引物延伸的模板，

d)通过置换与所述第一引物区域互补的待扩增的核酸链的链，将激活物寡核苷酸与第一延伸引物寡核苷酸的第一引物区域结合，

e)通过置换与所述延伸产物互补的待扩增的核酸链的链，将激活物寡核苷酸与第一延伸引物寡核苷酸的延伸产物的互补区段结合，其中第一引物延伸产物的3'区段变成单链，

f)将第二寡核苷酸引物与第一引物延伸产物杂交，其中第二寡核苷酸引物的3'区段包含可与第一引物延伸产物杂交的序列；和

g)用聚合酶延伸第二寡核苷酸引物以形成第二引物延伸产物，其中延伸发生直至并包括第一引物寡核苷酸的第一引物区域，并且所述第一引物区域通过聚合酶复制，其中第二区域的多核苷酸尾保持未被复制，

h)重复步骤a)-g)直至达到所期望的扩增程度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法基本上以等温的方式实施。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于激活物寡核苷酸的第三单链区域基本上与第一引物延伸产物的已通过聚合酶合成的延伸产物的区段互补，所述第一引物延伸产物紧接在第一引物区域之后。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法的步骤(e)被修改为：它包括通过置换待扩增的核酸链的链将激活物寡核苷酸与第一延伸引物寡核苷酸的延伸产物的互补区段结合，所述待扩增的核酸链的链与所述延伸产物互补直到待扩增的核酸的所述互补链与第一引物延伸产物分离，其中第一引物延伸产物的3'区段变成单链。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法的步骤(f)被修改为：其包括第二寡核苷酸引物与第一引物延伸产物的杂交，其中同时存在激活物寡核苷酸通过链置换从与第一延伸产物的结合中的至少部分的置换。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于对该方法的步骤(g)进行修改，使其包括在聚合酶的参与下从与第一引物延伸产物的结合中置换激活物寡核苷酸。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法的步骤(h)被修改为：它包括将激活物寡核苷酸与第一延伸引物寡核苷酸的未复制的多核苷酸尾结合，以及从与第一引物延伸产物的结合中置换第二引物延伸产物，同时形成具有第一引物寡核苷酸的第一特异性延伸产物的区段的互补双链。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在允许重复步骤(a)至(g)的条件下进行所述步骤的重复。

9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于它包括通过使用第一和第二引物寡核苷酸以及激活物寡核苷酸在指数反应中同时扩增第一和第二引物延伸产物，其中形成的引物延伸产物用作相互合成的模板。