[发明专利]多蛋白酶方法

权利要求书

1.一种鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：

(i)使用单一第一蛋白酶或第一蛋白酶的组合对所述蛋白质执行限制性或约束性蛋白水解；

(ii)使用单一第二蛋白酶或第二蛋白酶的组合对步骤(i)获得的蛋白质执行非限制性蛋白水解或执行限制性或约束性蛋白水解，其中所述第二蛋白酶均不同于步骤(i)中使用的蛋白酶；

(iii)分析在步骤(ii)中从所述蛋白质释放的肽，以鉴别其中一端已被所述第一蛋白酶切割而另一端已被所述第二蛋白酶切割的肽；

(iv)探测蛋白质区域中的一个或多个表位，所述蛋白质区域含有或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(iii)中鉴别的所述第一蛋白酶的切割位点，其中一种或多种抗体针对所述表位，从而鉴别可被抗体结合的所述蛋白质上一个或多个表位。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(ii)中执行非限制性蛋白水解。

3.根据权利要求1所述的方法，其中单一第一蛋白酶在步骤(i)中使用。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中单一第二蛋白酶在步骤(ii)中使用。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中在步骤(ii)中执行非限制性蛋白水解，其中所述方法进一步包括，在步骤(i)之后，但在步骤(ii)之前的额外步骤，所述额外步骤使用在步骤(ii)中使用的所述单一第二蛋白酶或第二蛋白酶的组合对步骤(i)获得的蛋白执行限制性或约束性蛋白水解。

6.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述单一第一蛋白酶或所述第一蛋白酶的组合选自：胰蛋白酶、Arg-C、Lys-C和Lys-N。

7.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述单一第一蛋白酶或所述第一蛋白酶的组合选自：胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和Glu-C。

8.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述单一第二蛋白酶或所述第二蛋白酶的组合选自：胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和Glu-C。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述单一第二蛋白酶或所述第二蛋白酶的组合选自：胰蛋白酶、Arg-C、Lys-C和Lys-N。

10.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(ii)之前、之中或之后实施的变性步骤。

11.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述肽用质谱法分析。

12.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中探测多个表位。

13.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(iv)之前产生一个或多个分离的表位的步骤，所述分离的表位具有对应于所述蛋白质上一个或多个表位的序列，所述一个或多个表位位于含有或侧接切割位点的蛋白质区域中，所述切割位点是步骤(iii)中鉴别的所述第一蛋白酶的切割位点，和产生针对所述分离的表位的抗体，和在步骤(iv)中使用所述抗体探测所述蛋白质上的所述一个或多个表位。

14.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述表位在所述第一蛋白酶的所述切割位点的20个氨基酸内。

15.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中探测多个表位，并且其中所述多个表位是一组表位，其中所述组中每个表位的序列相对于所述组中的另一个表位偏移1、2或3个氨基酸。

16.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中步骤(i)和(ii)中的所述蛋白水解在蛋白质上执行，所述蛋白质是存在于衍生自细胞的蛋白脂质体中。