[发明专利]用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法

说明书

本发明涉及用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法。

技术领域

本发明涉及用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法。

背景技术

核苷酸重复序列扩张区(nucleotide repeat expansion)，尤其是三核苷酸重复序列扩张区，涉及超过二十余种神经和发育障碍。已经提出治疗这些疾病的一种方法是使用高度特异性的核酸酶将重复序列缩短至非病理性长度(参见Richard GF的综述，TrendsGenet.2015年4月；31(4)：177-186)。

高度特异性的核酸酶例如兆核酸酶(meganuclease)、ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9核酸酶已用于这样的策略中。然而，本领域技术人员认为后者不适合用于切除三核苷酸重复序列扩张区(参见上文引用的Richard)。总之，TALEN被认为是更有前途的缩短三核苷酸重复序列的工具。

针对这种强烈的偏见，本发明人在此表明可以实施CRISPR-Cas9系统以从DMPK基因中的基因组DNA切除核苷酸重复序列扩张区，从而提供用于治疗肌强直性营养不良的强大且意想不到的工具。更特别地，本发明人发现了如何使用源自于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9来改善DMPK基因内核苷酸重复序列扩张区的切除效率。

发明内容

本发明人已经表明，针对上文展现的强烈偏见，CRISPR-Cas9系统可以有效地用于切除核苷酸重复序列扩张区。本发明涉及使用源自于金黄色葡萄球菌(S.aureus)并具有适当的单个向导RNA(single guide RNA)(sgRNA)的CRISPR-Cas9系统来切除DMPK基因内核苷酸重复序列扩张区的改进工具。

在一个方面，本文公开了可用于从DMPK基因的3'-UTR特异性切除核苷酸重复序列扩张区、尤其是三核苷酸重复序列扩张区的单个向导RNA(sgRNA)分子。本文公开的sgRNA分子能够通过碱基配对与所靶向的核苷酸扩张区的5'或3'的基因组DNA靶序列(前间区序列)的互补序列结合，并且能够将Cas9内切核酸酶募集至sgRNA和基因组DNA之间的杂交位点或附近。更确切地说，本文用于切除三核苷酸重复序列扩张区的Cas9内切核酸酶源自于金黄色葡萄球菌(SaCas9)。本发明的sgRNA分子包含适合于在所述互补位点附近诱导SaCas9介导的双链断裂的所有序列元件。特别地，本申请公开了适合于实现DMPK基因的3'-非翻译区(3'-UTR)中存在的核苷酸重复序列扩张区的切除的sgRNA对，其中所述sgRNA对包含第一sgRNA和第二sgRNA，所述第一sgRNA与位于所述核苷酸重复序列扩张区的5'的靶基因组DNA序列互补，并且所述第二sgRNA与位于所述核苷酸重复序列扩张区的3'的靶基因组DNA序列互补。所述第一sgRNA分子能够在Cas9内切核酸酶的存在下在DMPK基因的3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的5'的双链断裂。所述第二sgRNA分子能够在Cas9内切核酸酶的存在下在DMPK基因的3'-UTR内诱导所述核苷酸重复序列扩张区的3'的双链断裂。在本发明的上下文中，所述Cas9内切核酸酶源自于金黄色葡萄球菌(SaCas9)，或所述Cas9内切核酸酶是SaCas9的功能性变体。

所述第二sgRNA分子包含15-40个核苷酸的向导序列，所述向导序列包含SEQ IDNO：12中所示的核苷酸序列。在一个特定实施方式中，所述第二sgRNA的向导序列由选自SEQID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：21的核苷酸序列组成。

在一个特定实施方式中，所述第一sgRNA分子包含长度为15-40个核苷酸的向导序列，所述向导序列包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的核苷酸序列。

本发明的另一个方面涉及一种sgRNA，其包含能够通过碱基配对与靶基因组DNA序列的互补序列结合的序列，所述靶基因组DNA序列位于DMPK基因的3'-UTR内的核苷酸重复序列扩张区的5'或3'；