[发明专利]包含工程化内皮细胞的血脑屏障

说明书

本发明部分地涉及包含工程化E40RF1+内皮细胞的血脑屏障样组织(boold‑brain barrier‑like tissues)，以及在体外和体内用于制备和使用所述血脑屏障样组织的各种组合物和方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年9月13日提交的美国临时专利申请No.62/393,774的优先权，其内容在此以引用的方式整体并入本文。

通过引用的方式并入

本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其他参考文献都通过引用的方式整体并入本文。

背景技术

血脑屏障(BBB)将循环血液与细胞外液和中枢神经系统(CNS)的细胞分离。在体内，BBB由彼此紧密连接的脑内皮细胞与基底膜和星形胶质细胞(一种神经胶质细胞)形成。BBB具有高电阻以及用于限制某些分子和微生物(例如细菌)进入CNS的功能，但同时可以允许水，一些气体和一些必需分子(例如葡萄糖和氨基酸)通过被动扩散或选择性主动运输进入CNS。

虽然BBB的屏障功能提供了体内必需的安全机制-保护脑和脊髓组织-同样的屏障功能可以对治疗中枢神经系统的治疗剂的开发构成挑战-其中穿过BBB的药物将是有益的。相反，当开发可能对CNS组织具有不良影响的药物时，可能需要开发不能透过BBB的药剂。因此，本领域需要研究可用于研究治疗药剂透过BBB的能力的模型系统，并筛选具有所需BBB渗透性的药剂，以及研究BBB在正常和疾病情况下的其他生物学特性。

本领域还需要治疗、修复或替换体内发生的BBB损伤的方法，例如由于创伤性损伤，疾病或感染造成的BBB损伤。

本发明旨在解决所有这些需求。

发明内容

本发明部分地是基于以下令人惊讶的发现：经过工程化改造以表达腺病毒E4ORF1蛋白的内皮细胞可用于产生血脑屏障样组织(blood-brain barrier-like tissue)，其不仅忠实地复制许多BBB在体内的重要特征，且重要的是，在几个重要方面优于利用天然(即，非E4ORF1表达)内皮细胞的BBB系统。例如，如本发明申请的实施例部分中更详细描述的，现已证明，与包含天然EC的BBB系统相比，工程化E4ORF1+内皮细胞可用于产生具有显着改善的屏障功能的BBB样组织(提高了的跨内皮电阻(trans-endothelial electricalresistance,“TEER”)和降低了的渗透系数)。虽然先前已知E4ORF1表达改善了培养物中EC细胞的存活率(参见美国专利号8,465,732。另见Seandel等人，(2008),PNAS,105(49):19288-93)，E4ORF1对内皮屏障功能的这种作用却是出乎意料的。

另外，如本发明申请的实施例部分中更详细描述的，现在还发现，与天然EC不同，工程化E4ORF1+EC可长期保持与星形胶质细胞的直接接触(即，两种细胞类型之间没有物理屏障)，当细胞以这种方式与星形胶质细胞共培养时，工程化E4ORF1+EC的屏障功能得到显着改善。同样，E4ORF1对内皮-星形胶质细胞相互作用的这种影响也是出乎意料的。

使用工程化E4ORF1+EC而不是天然EC来产生BBB样组织或系统的进一步好处是，与天然EC不同-其需要血清和/或生长因子(例如VEGF)用于培养基中的长期存活，而工程化E4ORF1+EC即使在不存在血清和生长因子的情况下也可以长期(例如超过1个月)在培养中维持。这在BBB组织/系统的情况下提供了特别重要的益处，因为血清和生长因子(例如VEGF)是已知能够导致不希望发生的BBB渗漏(即，降低了的阻抗(resistance)/增加了的渗透性)，如本申请的图4所证实的。

基于这些发现以及本专利申请的实施例和附图部分中描述的其他发现，本发明提供了几种新的和改进的BBB系统，组合物和方法。