[发明专利]化学修饰的编辑RNA的单链寡核苷酸

说明书

本发明涉及能够在真核细胞中对靶RNA序列的靶核苷酸(腺苷)进行特异性编辑的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸本身不形成分子内发夹或茎‑环结构，并且其中所述寡核苷酸在与靶RNA序列中待编辑的核苷酸相对的位置包含非互补核苷酸。

技术领域

本发明涉及医药领域。特别地，它涉及RNA编辑领域，其中RNA序列由单链反义寡核苷酸靶向以校正基因突变和/或改变特定靶RNA的序列。更具体地，本发明涉及对编辑RNA的单链寡核苷酸的化学修饰，其使得寡核苷酸更稳定并提高其RNA编辑效率。

背景技术

RNA编辑是真核细胞改变其RNA分子序列的自然过程，通常以位点特异性和精确的方式改变，从而将基因组编码的RNA的谱系增加几个数量级。已经描述了用于整个动物和植物界的真核物种的RNA编辑酶，并且这些过程在从最简单的生命形式如秀丽隐杆(Caenorhabditis)线虫到人类的后生动物中在控制细胞稳态方面起重要作用。RNA编辑的实例分别是通过称为腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶的酶，腺苷(A)至肌苷(I)和胞苷(C)至尿苷(U)的转换。最广泛研究的RNA编辑体系是腺苷脱氨酶。

腺苷脱氨酶是多结构域蛋白，包含识别结构域和催化结构域。识别结构域识别特定的双链RNA(dsRNA)序列和/或构象，而催化结构域通过核碱基的脱氨基作用将靶RNA中附近的、或多或少预定位置的腺苷转化为肌苷。通过细胞的翻译机制将肌苷读作鸟苷，这意味着，如果所编辑的腺苷位于mRNA或前mRNA的编码区中，则其能够重编码蛋白序列。

A至I转换也可发生在靶mRNA的5’非编码序列中，在原始起始位点的上游产生新的翻译起始位点，其产生N-末端延长的蛋白。编辑事件也能够发生在3’UTR处并影响基于miRNA的调节和多腺苷酸化。此外，A至I转换可发生在前mRNA中的内含子或外显子中的剪接元件中，从而改变剪接的模式。因此，可包括或跳过外显子。腺苷脱氨酶是称为作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)的酶家族的一部分，ADAR包括人脱氨酶hADAR1、hADAR2和hADAR3。

应用腺苷脱氨酶使用寡核苷酸编辑靶RNA是本领域已知的。Montiel-Gonzalez等人(PNAS 2013,110(45):18285–18290))描述了使用基因工程融合蛋白编辑靶RNA，该融合蛋白包含hADAR2蛋白的腺苷脱氨酶结构域，与识别boxB RNA发夹序列的噬菌体λN蛋白融合。已除去hADAR2的天然dsRNA结合结构域以消除天然ADAR的底物识别特性，并用λN蛋白的boxB识别结构域代替它。作者创造了一种反义寡核苷酸，其包含与用于编辑的靶序列互补的‘引导RNA’部分，该部分与用于通过N-结构域-脱氨酶融合蛋白进行序列特异性识别的boxB部分融合。通过这样做，巧妙地显示引导RNA寡核苷酸如实地将腺苷脱氨酶融合蛋白导向靶位点，导致引导RNA导向的对靶RNA的位点特异性A至I编辑。Montiel-Gonzalez等人(2013)公开的引导RNA长度超过50个核苷酸。该方法在治疗环境中的缺点是需要一种融合蛋白，该融合蛋白由噬菌体λN蛋白的boxB识别结构域基因融合至截短的天然ADAR蛋白的腺苷脱氨酶结构域组成。它需要用融合蛋白转导靶细胞，这是一个主要障碍，或者用编码工程化腺苷脱氨酶融合蛋白的核酸构建体转染靶细胞用于表达。当要在多细胞生物体中实现编辑时，比如在针对人类疾病以纠正遗传病症的治疗中，后一种要求构成不小的障碍。