[发明专利]用于检测BK病毒的组合物和方法

说明书

描述了用于快速检测生物样品或非生物样品中是否存在BK病毒的方法。该方法可以包括执行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，提供了靶向BK病毒的引物和探针，以及试剂盒，它们被设计用于检测BK病毒。

技术领域

本公开文本涉及体外病毒诊断领域。在该领域内，本发明涉及使用引物和探针对样品中可能存在的靶核酸进行扩增和检测，并且具体地涉及对BK病毒的包含序列变异和/或个体突变的靶核酸进行扩增、检测和定量。本发明还提供了含有引物和探针的反应混合物和试剂盒，用于对BK病毒进行扩增和检测。

背景技术

在1971年首次从具有输尿管狭窄的肾移植接受者的尿液中分离BK病毒(多瘤病毒科(Polyomaviridae/polyomavirus family)的一员)，缩写为“B.K.”。多瘤病毒科包括JC病毒(John Cunningham virus，JCV)和猿猴病毒SV40。虽然BK病毒感染很普遍，但被感染的个体通常无症状或仅展现出轻微症状(如呼吸道感染或发热)。BK病毒是一种环状双链DNA病毒。它的基因组编码三种衣壳结构蛋白(即病毒衣壳蛋白1(VP1)、VP2和VP3)，以及大T抗原和小t抗原。

该病毒典型地在原发性感染后潜伏在尿路上皮细胞和肾小管上皮细胞中。据信高达80％的人群含有潜伏形式的该病毒。对于免疫抑制和/或免疫低下的个体，BK病毒感染的症状明显更严重，例如在器官移植的设定中。在这种情况下，临床表现可能包括肾功能不全以及尿液中存在肾小管细胞和炎性细胞。具体地，在免疫抑制或免疫力受损的设定中，病毒再激活并复制，从肾小管细胞溶解和病毒尿症开始引发一系列事件。然后，病毒在间质中扩增并进入管周毛细血管，引起病毒血症并最终侵入同种异体移植物，导致各种肾小管间质病变和BK肾病(BKVN)。BK病毒显著促进了移植物丧失的可能性的增加。BK病毒是一种常见的移植后机会性病毒感染，在移植后第一年影响大概15％的肾移植接受者。如不解决，BK肾病将进展为同种异体移植失败。

尽管免疫抑制和/或免疫力受损仍然是BK病毒感染的主要风险因素，但其他风险因素包括男性性别、接受者年龄较大、既往排异事件、人类白细胞抗原不匹配度、冷缺血时间延长、BK血清状态和输尿管支架放置。症状性BK病毒感染个体的治疗选择有限，并且没有有效的预防措施。治疗的基础是单纯减少免疫抑制剂，这增加了同种异体移植排斥的风险。也采用抗病毒药物，但结果不一致。BK病毒现在被认为是肾移植接受者间质性肾炎和同种异体移植失败的主要原因。

BK病毒感染是通过针对诱饵细胞进行BK病毒血液测试或尿液测试来诊断。诱饵细胞的存在是一种敏感量度，但是对于BK肾病的诊断具有低阳性预测值(29％)(参见Mbianda等人,Journal of Clinical Virology 71:59-62(2015)。定量具有病毒DNA或mRNA的血浆和尿液中的病毒载量也被用于诊断BK肾病。然而，移植肾活检仍然是诊断BK病毒肾病的金标准。

在分子诊断学领域，核酸的扩增和检测具有重要意义。此类方法可用于检测任何数量的微生物，如病毒和细菌。最突出和广泛使用的扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。其他扩增技术包括连接酶链式反应、聚合酶连接酶链式反应、Gap-LCR、修复链式反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)和Qβ扩增。

基于PCR的分析的自动化系统通常利用在同一反应容器中在PCR过程中的产物扩增实时检测。此类方法的关键是使用携带报告物基团或标记的经修饰寡核苷酸。

估计80％的人群携带潜伏状态的BK病毒，其中许多人并未意识到这一状况，因为BK病毒感染的症状非常轻微或根本不存在。诊断BK肾病的金标准是移植肾活检，这是一个耗时、侵入性和费力的过程。因此，本领域需要一种快速、可靠、特异和灵敏的方法来检测和定量生物样品中BK病毒的存在。

发明概述