[发明专利]高纯度RNA组合物及其制备方法

权利要求书

1.一种产生信使核糖核酸(mRNA)的方法，所述mRNA包含编码疫苗抗原或者治疗性蛋白质或肽的开放阅读框，所述方法包括温育：

(a)包含脱氧核糖核酸(DNA)、RNA聚合酶、缓冲液、腺苷三磷酸(ATP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)和鸟苷三磷酸(GTP)以及缓冲液的反应混合物，以产生包含所述mRNA的体外转录(IVT)的RNA组合物，

其中：

(1)GTP、ATP、CTP和UTP的浓度的比率为4:2:1:1；或者

(2)所述反应混合物还包含鸟苷二磷酸(GDP)，并且GDP、GTP、ATP、CTP和UTP的浓度的比率为4:2:2:1:1。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述UTP是天然UTP。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述UTP是经修饰的UTP，其中所述经修饰的UTP包含假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷或5-甲氧基尿苷。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述经修饰的UTP包含假尿苷或N1-甲基假尿苷。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述经修饰的UTP包含N1-甲基假尿苷。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述经修饰的UTP包含经修饰的糖，其中所述经修饰的糖是2'-O-甲基核糖。

7.如权利要求1的方法，其中所述RNA聚合酶选自T7聚合酶、T3聚合酶和SP6聚合酶。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述RNA聚合酶是T7聚合酶。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA是cDNA。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液包含镁。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物还包含二硫苏糖醇(DTT)、亚精胺、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶或其组合。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含RNA酶抑制剂。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物在25℃或37℃下温育。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述mRNA包含编码目的多肽的开放阅读框，其中所述目的多肽是治疗性蛋白质或疫苗抗原。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物中反向转录互补产物少于10％的RNA总质量。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物中不存在RNA酶III不敏感片段。

17.如权利要求1所述的方法，其中大于90％的所述RNA的质量包含单链全长转录物。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含处于有义方向的单链部分RNA转录物群并且其中大于75％的处于有义方向的所述单链部分RNA转录物群具有100个核苷酸或更少的核苷酸长度。

19.如权利要求1所述的方法，其中大于90％的处于有义方向的所述单链部分RNA转录物群具有100个核苷酸或更少的核苷酸长度。