[发明专利]用于纯化或分离微泡和外泌体的方法与组合物

说明书

本发明涉及外泌体的分离或提取。

技术领域

本发明涉及细胞微泡、特别是外泌体，涉及分子建模并且涉及用于分离和隔离分子的色谱方法，包括离子交换色谱法。

发明背景

本说明书中对任何现有技术的引用不是并且也不应被视为承认或以任何形式暗示这种现有技术构成澳大利亚或任何其他管辖区域的公知常识的一部分。

微泡是由膜结合的生物结构的异质集合。这些结构具有脂质双层，并且它们可存在于细胞内或细胞外环境中。微泡的大小在约20nm至1000nm的范围内。

外泌体是小的脂质双层囊泡，由多种细胞类型分泌，并且直径在20至约150nm的范围内(如通过电子显微镜(EM)所测定)。与其他细胞来源的微泡不同，外泌体在细胞内空间内形成，并且然后由细胞分泌(Raposo和Stoorvogel，2013)。

外泌体的脂质组成不同于起源细胞的脂质组成，但仍然是它们所起源的细胞类型的某种特征。此外，外泌体显示一些与其起源无关的常见脂质特征(Urbanelli等人，2013)。

取决于它们的起源，外泌体可含有多种“货物”，包括但不限于肽、蛋白质、脂质、转录调控因子，信使RNA(mRNA)、非编码RNA(ncRNA)和双链DNA(dsDNA)。

外泌体现在被认为是在诸如神经元突触、免疫调控、血管生成、组织再生和表观遗传调节的情况下，起源细胞(即外泌体所起源的细胞)可与靶细胞通讯的手段。这种通讯可以是本地化的或远程的。实际上，来自母乳的外泌体可调节新生儿的免疫和其他功能。这种通讯甚至可以是跨物种，例如但不限于调节人的免疫和其他功能的牛乳外泌体。

外泌体可来源于各种生物流体，包括唾液、尿液、血液、血浆、(乳房)乳汁、滑液、腹水、汁液和果实提取物。

综上所述，似乎外泌体的独特特征由它们的大小、通过内吞作用的细胞摄取、它们的“货物”驱动，并且它们递送在靶细胞中具有生物活性的“信息”。

存在越来越多的证据表明外泌体可在各种疾病的发病和持续中起作用。从生物样品收集的外泌体可提供关于疾病当前状态的诊断信息。外泌体中RNA的浓度可比从体液(如血液)中直接提取的RNA的浓度高多达60倍，从而驱动它们在诊断学中的效用的潜力。例如，鉴定从人体液分离的外泌体内的致癌性RNA标志可潜在地在侵袭性癌症发展之前良好地产生异常状态的诊断。

最近已经表明，治疗性间质型细胞的功能不依赖于细胞本身，而是由细胞产生的旁分泌因子(包括外泌体)，从而确定外泌体是循环细胞分泌因子的一部分，所述循环细胞分泌因子可介导在一些细胞疗法中以无细胞方式观察到的作用(Rani等人，2015)。

从经历体外培养的细胞的条件培养基收集的治疗上有用的外泌体也可用作无细胞治疗剂，但是需要从其源液中分离的稳健、灵活的方法(Chen等人，2010)。

此外，当基于细胞的表达系统专门定制时，外泌体可提供填充有治疗性蛋白质和RNA的天然递送载体。

在常规光学显微镜下，外泌体是不可见的。用于检测这些超微观粒子如外泌体和微泡的技术包括电子显微镜(EM)、流式细胞术、动态光散射(DLS)和纳米粒子跟踪分析(NTA)。据报道，根据所使用的方法，报告的一升血液中细胞外囊泡的绝对数量可变化多达五个数量级(van der Pol等人，2010)。

虽然外泌体是丰富的并且预期在诊断或治疗意义上有用，但是用于分离和纯化外泌体的方式限制了它们迄今为止的临床应用。

通常，用于外泌体分离的现有方法特征在于以下两组：

(i)由于囊泡的某些(可能是独特的)选择性外部特征(例如糖蛋白标记物、跨膜蛋白如四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82)和MHCI类和II类以及细胞溶质蛋白如热休克蛋白(HSP-70和HSP-90))所致的亲和力捕获