[发明专利]用于低温电子显微镜的可冻结流体单元

说明书

公开了一种使用可冷冻流体单元系统对生物样本进行成像的系统和方法。可冷冻流体单元包括顶部芯片、底部芯片和间隔件，以控制玻璃化生物样本的厚度。间隔件定位在顶部芯片和底部芯片之间以限定通道，该通道与可冷冻流体单元系统的入口端口和出口端口流体连通。通道可以用生物样本来填充，被玻璃化并成像以产生高分辨率电子显微镜图像。

相关申请的交叉引用

本申请基于，要求于2016年12月6日提交的美国临时专利申请第62/430,666号的权益，并通过引用结合于此。

关于联邦资助研究的说明

不适用。

技术领域

本公开涉及低温电子显微镜和用于保持低温电子显微镜的样本的改善的流体单元。

背景

低温电子显微镜(“cryo-EM”)是在玻璃化含水样本的薄膜上执行的成像技术。Cryo-EM在结构生物学中越来越普及，并且使得在分子分辨率下观察单元、病毒和蛋白质组装体在其原始状态下的结构成为可能。Cryo-EM基于在低温条件和高真空下在透射电子显微镜中对辐射敏感样本进行成像的原理。

将冷冻的水溶液浸入冷冻剂(诸如液体乙烷)中是用于制备用于低温EM应用的样本的常用方法。在低温下冷冻样本会降低对生物样本造成的辐射损伤程度。具体而言，电子辐射导致化学键断裂和自由基的产生，这反过来又导致对样本的进一步损伤。快速冷冻或玻璃化薄冷冻层中的生物样本的方法的发展允许减少辐射损伤并且允许以更高的辐射剂量对样本进行成像。另外，在低温下保存生物样本允许在高真空下保存生物样本。

发明内容

本文公开了一种使用可冷冻流体单元用于低温电子显微镜成像生物样本的系统和方法。如本文所使用的，术语“生物样本”是指多种大分子组装体，包括但不限于蛋白质分子、小肽、单个细菌、病毒、完整组织切片、和插入冷冻单元。在所公开的方法中，将包含生物样本的水性液滴引入可冷冻流体单元的入口端口，其中通过毛细管作用将生物样本拉入设备中。然后将生物样本拉入单元内的薄的、平面流体单元方案。然后快速冷却可冷冻的流体单元以将生物样本固定在冰的薄膜中，其可替代地称为玻璃化生物样本。然后可以使用低温电子显微镜对薄膜成像。

用于对cryo-EM样本进行成像的先前方法使用机器人印迹方法来创建通常被较差地控制的薄的玻璃化生物样本。也就是说，机器人印迹方法通常包括将几微升纯化的蛋白质溶液沉积到金属(通常是铜)网格上，在其上面是配置有孔的无定形碳薄膜。一部分蛋白质溶液进入无定形碳网格的孔中，并且在液体乙烷中插入冷冻之前使用过滤纸将剩余的溶液吸去。这些先前的印迹方法导致由于大的空气-液体界面和大分子组装体的浓度梯度而具有可变冰厚度的冷冻样本。可变冰厚度和浓度梯度需要对玻璃化生物样本进行时间密集的人工筛选以定位合适的区域以用于成像。此外，与先前印迹方法相关联的可变冰厚度导致跨样本的背景噪声信号不一致。不一致的背景噪声信号使数据后处理和图像重建变得复杂。此cryo-EM的样本制备阶段被广泛认为是结构测定的瓶颈和结构测定自动化的障碍。

本公开通过提供可冷冻的流体单元来限定生物样本的冰厚度，从而解决了上述缺点。本公开还移除了使用机器人印迹方法在很大程度上不可避免的气体-液体界面，这在三维结构确定中可能是有问题的。通过移除气体-液体界面并在平面流体单元方案内将生物样本插入冷冻，本公开解决了可变冰厚度和较差的大分子分布的问题。