[发明专利]用于DNA突变的多重检测的图像差异多重测定

权利要求书

1.一种用于检测KRAS、BRAF、CTNNB1和APC基因中的DNA突变的存在的方法，所述方法包括：

(a)从样品中分离DNA；

(b)使用对所述KRAS、BRAF、CTNNB1和APC基因中的每一种中的一个或多个DNA突变的基因座具有特异性的引物对，通过聚合酶链反应(PCR)扩增所述分离的DNA；

(c)使所述扩增的DNA与至少四种探针杂交，所述至少四种探针包括一种或多种对所述KRAS、BRAF、CTNNB1和APC基因中的每一种中的DNA突变具有特异性的探针，其中所述至少四种探针中的每一种偶联至微载体，并且其中所述微载体中的每一种包含对应于与其偶联的所述探针的标识符；

(d)检测所述扩增的DNA与所述至少四种探针的杂交的存在或不存在，其中所述扩增的DNA与所述探针之一之间的杂交表明存在对应于所述探针的所述DNA突变；

(e)检测所述微载体的标识符；以及

(f)使检测到的所述微载体的标识符与检测到的所述扩增的DNA与所述微载体的相应探针的杂交的存在或不存在相关联。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述KRAS、BRAF、CTNNB1和APC基因为人基因。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(b)包括在所述至少四种阻断核酸存在的情况下通过PCR扩增所述分离的DNA，其中所述至少四种阻断核酸中的每一种与对应于所述KRAS、BRAF、CTNNB1或APC基因中的所述DNA突变中的一种的野生型DNA基因座杂交，并阻止所述野生型DNA基因座的扩增。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述至少四种阻断核酸中的每一种包含：

与所述相应野生型DNA基因座杂交的单链寡核苷酸；和

阻断所述单链寡核苷酸延伸的3'末端部分。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述3'末端部分包含一个或多个反向脱氧胸苷。

6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述至少四种阻断核酸中的每一种包含一种或多种选自由以下组成的组的经修饰的核苷酸：锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、己糖核酸(HNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)和环己烯基核酸(CeNA)。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述KRAS基因中的一个或多个DNA突变包括编码G12D、G12V、G12S或G13D突变的KRAS蛋白的一个或多个DNA突变。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列其中n为1、2或3(SEQ ID NO:3)；其中n为1、2或3(SEQ ID NO:142)；其中n为1、2或3(SEQ ID NO:143)；其中n为1、2或3(SEQ ID NO:144)；或其中n为1、2或3(SEQ ID NO:145)，其中斜体核酸表示锁核酸。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述BRAF基因中的一个或多个DNA突变包括编码V600E突变的BRAF蛋白的一个或多个DNA突变。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列其中n为1、2或3(SEQ ID NO:10)；其中n为1、2或3(SEQ ID NO:146)；其中n为1、2或3(SEQ ID NO:147)；其中n为1、2或3(SEQ ID NO:148)；或其中n为1、2或3(SEQ ID NO:149)，其中斜体核酸表示锁核酸。

11.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述CTNNB1基因中的一个或多个DNA突变至少包括编码T41A或T41I突变的CTNNB1蛋白的第一CTNNB1突变。