[发明专利]使用核酸外切酶和链移位的核酸扩增

权利要求书

1.扩增核酸序列的方法，其包括：

(a)提供扩增混合物，所述扩增混合物包含：

(i)能够实现双链核酸分子的链的消化的核酸外切酶，所述消化从所述链的5′-末端朝向3′-末端，

(ii)链移位聚合酶，

(iii)双链核酸分子，其包含彼此杂交的第一和第二核酸链，包含待扩增的第一核酸序列并具有远离其5′-末端的第一5′-末端区的所述第一链具有抵抗通过如(i)所定义的所述核酸外切酶的消化(在该方法的条件下)的核苷酸序列，

(iv)第一核酸引物，其具有与所述第一核酸的第一末端区相同的核苷酸序列，并且包含相同的消化抗性区，和

(v)核苷酸，其适合于供给用于扩增所述待扩增的第一核酸序列；和

(b)在允许消化、核酸外切酶消化和链移位聚合的条件下实现扩增反应，从而产生包含扩增量的所述第一核酸序列的产物混合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一链的5'-末端和第二链的3'-末端一起为所述双链核酸分子提供平末端。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一链的5'-末端具有5'-磷酸基团，并且所述核酸外切酶是，在扩增混合物中优先消化在其5'-末端具有磷酸(PO₄)基团的双链核酸分子的链的核酸外切酶，所述消化从所述链的该末端朝向其3'-末端。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述核酸外切酶是λ-核酸外切酶。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一末端区和所述第一引物的消化抗性区各自包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一末端区和所述第一引物的消化抗性区各自包含多个硫代磷酸酯核苷酸的连续序列。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一末端区的消化抗性区位于其末端的中间，和相应地，所述第一引物的消化抗性区位于其末端的中间。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述第二核酸链具有其远离其5'-末端的第二5'-末端区，具有抵抗通过如(i)所定义的所述核酸外切酶的消化(在该方法的条件下)的核苷酸序列，并且所述扩增混合物包含与第二核酸链的所述第二末端区相同的第二引物。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述双链核酸分子具有平末端。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述第一和第二链各自的5'-末端具有5'-磷酸基团，并且所述核酸外切酶是，在扩增混合物中优先消化在其5'-末端具有磷酸(PO₄)基团的双链核酸分子的链的核酸外切酶，所述消化从所述链的该末端朝向其3'-末端。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸外切酶是λ-核酸外切酶。

12.如权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述第一末端区、所述第一引物、所述第二末端区和所述第二引物的消化抗性区各自包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述第一末端区、所述第一引物、所述第二末端区和所述第二引物的消化抗性区各自包含多个硫代磷酸酯核苷酸的连续序列。

14.如权利要求8至13中任一项所述的方法，其中所述第一末端区和第二末端区的消化抗性区位于其末端的中间，和相应地，所述第一引物和所述第二引物的消化抗性区位于其末端的中间。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其额外包括检测扩增序列。