[发明专利]用于体外糖工程化抗体的方法

权利要求书

1.一种产生(糖基化修饰的)抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

-通过将包含抗体的溶液施加到固定的抗体轻链亲和配体，形成抗体-抗体轻链亲和配体复合物，其中抗体轻链亲和配体固定在固相上，

-将前一步骤中形成的复合物与一种或多种酶(和一种或多种活化的糖残基)孵育，以修饰抗体的糖基化，和

从而产生(糖基化修饰的)抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其在孵育步骤之后包括步骤

-从抗体轻链亲和配体中回收修饰的抗体。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其按以下顺序包括以下步骤

-将包含在N-糖基化位点具有糖基化的抗体的(缓冲)溶液施加到与固相结合的抗体轻链亲和配体，由此抗体与配体结合(产生配体结合的抗体)，

-任选地用缓冲溶液洗涤固相(不解吸附抗体/不破坏配体抗体复合物)，

-通过以下酶促修饰抗体的N-糖基化位点上的糖基化：

-施加包含第一糖基化修饰酶(和第一活化的糖残基)的第一(缓冲)溶液足够的时间，并在适于酶促修饰配体结合的抗体的条件下施加，任选地洗涤修饰的配体结合的抗体，施加包含第二糖基化修饰酶(和第二活化的糖)的第二(缓冲)溶液足够的时间，并在适于酶促修饰经修饰的配体结合的抗体的条件下施加，任选地洗涤修饰两次的配体结合的抗体，或

-施加包含第一糖基化修饰酶(和第一活化的糖)的第一(缓冲)溶液足够的时间，并在适于至少部分酶促修饰配体结合的抗体的条件下施加，在确定的一段时间后，施加包含第二糖基化修饰酶(和第二活化的糖)的第二(缓冲)溶液足够的时间，并在适于酶促修饰经修饰的配体结合的抗体的条件下施加，任选地洗涤修饰两次的配体结合的抗体，或

-施加包含第一和第二糖基化修饰酶(和第一和第二活化的糖)的(缓冲)溶液足够的时间，并在适于酶促修饰配体结合的抗体的条件下施加，任选地洗涤修饰的配体结合的抗体，

-从抗体轻链亲和配体释放抗体，和

从而产生(糖基化修饰的)抗体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中抗体选自全长抗体、二价单特异性抗体、双特异性抗体、二价双特异性抗体、三价双特异性抗体、四价双特异性抗体、三价三特异性抗体、抗体Fab片段和四价四特异性抗体。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述抗体是二价或三价或四价双特异性抗体或Fab片段。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抗体是嵌合或人源化或人抗体。

7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述第一糖基化修饰酶是半乳糖基转移酶，并且所述第二糖基化修饰酶是唾液酸转移酶。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中溶液包含色谱纯化的抗体，(第一)糖基化修饰酶是GalT1，并且与(第一)糖基化修饰酶的孵育是在37℃或室温下持续24小时。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中溶液包含色谱纯化的抗体，(第二)糖基化修饰酶是ST6，并且与(第二)糖基化修饰酶的孵育是在37℃或室温下持续24小时。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中溶液是包含抗体的缓冲、无细胞的培养上清液，第一糖基化修饰酶是GalT1，第二糖基化修饰酶是ST6，其在第一糖基化修饰酶6至24小时后，优选24小时后添加，总孵育时间为在37℃或室温下24小时至48小时，优选30小时。