[发明专利]含硫羟基的切割试剂和氧化洗涤剂

权利要求书

1.用于检测在DNA序列中的经标记的核苷酸的方法，其包括下列步骤：

a)提供核酸模板和能够与所述模板杂交的引物以便形成引物/模板杂交复合物，包含含硫羟基的化合物的切割试剂，以及切割清除剂试剂；

b)向所述引物和模板添加DNA聚合酶和第一脱氧核苷三磷酸以便产生反应混合物，所述第一脱氧核苷三磷酸包含核碱基和糖，所述糖在3‘-O上包含可切割的保护基团，其中所述可切割的保护基团包含亚甲基二硫化物，其中所述脱氧核苷三磷酸进一步包含通过可切割的含氧亚甲基二硫化物的连接体附着至所述核碱基的第一可检测标记物；

c)使所述反应混合物经历使得由DNA聚合酶催化的引物延伸反应成为可能的条件，以便产生经修饰的引物/模板杂交复合物，其中所述第一脱氧核苷三磷酸被掺入；

d)检测在所述经修饰的引物/模板杂交复合物中的所述脱氧核苷三磷酸的所述第一可检测标记物；

e)在条件下引入所述切割试剂，以便从所述经修饰的引物/模板杂交复合物中去除所述可切割的保护基团和所述可检测标记物；和

f)引入所述切割清除剂试剂。

2.权利要求1的方法，其中所述切割试剂包含二巯基丙磺酸或其盐。

3.权利要求2的方法，其中所述二巯基丙磺酸或其盐在缓冲液中。

4.权利要求3的方法，其中所述缓冲液为CHES。

5.权利要求4的方法，其中所述切割试剂的pH在9.0和10.0之间。

6.权利要求5的方法，其中所述切割试剂的所述pH为9.5。

7.权利要求1的方法，其中所述切割清除剂为氧化清除剂。

8.权利要求7的方法，其中所述氧化清除剂为过氧化氢。

9.权利要求8的方法，其中所述过氧化氢在缓冲液中。

10.权利要求9的方法，其中所述缓冲液为TRIS。

11.权利要求10的方法，其中所述TRIS缓冲液处于在8.5和9.0之间的pH。

12.权利要求11的方法，其中所述TRIS缓冲液处于8.8的pH。

13.权利要求7的方法，其中所述氧化清除剂为叔丁基过氧化物。

14.权利要求1的方法，其中步骤b)的所述反应混合物在流动池中。

15.权利要求14的方法，其中所述流动池被安置在移动支持物上。

16.权利要求15的方法，其中所述移动支持物为旋转载物台。

17.权利要求14的方法，其中所述流动池的至少一部分是透明的。

18.权利要求14的方法，其中所述流动池被整合在仪器内。

19.根据权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括在步骤b)的重复期间添加第二脱氧核苷三磷酸，其中所述第二脱氧核苷三磷酸包含通过第二可切割的氧亚甲基二硫化物连接体而附着的第二可检测标记物，其中所述第二可检测标记物不同于所述第一可检测标记物。

20.根据权利要求1的方法，其中所述含硫羟基的化合物为基于邻位二硫羟基的化合物。

21.权利要求20的方法，其中所述第二脱氧核苷三磷酸的核碱基不同于所述第一脱氧核苷三磷酸的核碱基。