[发明专利]包含氧化还原调节蛋白的生物硫醇检测组合物

说明书

本发明涉及包含氧化还原调节蛋白的生物硫醇检测组合物、使用其检测生物硫醇的方法，以及用于检测生物硫醇的生物传感器/试剂盒。本发明提供了快速测量体液中游离生物硫醇的效果。此外，可以实时检测体液中总生物硫醇和游离生物硫醇之间的相对含量比及变化，这允许生物硫醇作为疾病的主要指标，通过其可以对各种疾病预测和警告。此外，由于通过生物硫醇的变化可以解释与主要疾病相关的各种氧化还原应激变化，因此本发明可以在将来为发病机制的调查研究和疾病的诊断提供重要的技术、经济和社会价值。

技术领域

本发明涉及包含氧化还原调节蛋白的生物硫醇检测组合物、使用该组合物的生物硫醇检测方法以及用于检测生物硫醇的生物传感器/试剂盒。

背景技术

生物硫醇例如蛋白质中存在的半胱氨酸是不同于硫醇的低分子量(LMW)硫醇，并且在所有生物体(从细菌到人类)中对体内氧化应激的抗性和生理活性的调节起重要作用。这种生物硫醇对氧化还原反应非常敏感，被诸如SOH、SO₂H、SNO或S-S的官能团修饰，并因此用作生物分子活性的调节开关。生物硫醇不仅在细胞中丰富，而且是在诸如血液、尿液、汗液和泪液的主要人体体液中被广泛检测到。存在于体液中的生物硫醇包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、半胱胺(CA)、γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GluCys)、半胱氨酰甘氨酸(CysGly)、N-乙酰半胱氨酸(N-AC)、辅酶A(CoA)、辅酶B(CoB)、辅酶M(CoM)、芽孢杆菌硫醇(bacillithiol)(BacT)、放线硫醇(mycothiol)(MyT)、麦角硫因(ErT)和锥虫硫酮(trypanothione)(TrT)。据报道，这些生物硫醇中的特别是Cys、Hcy和GSH的浓度的体内变化与各种类型的疾病密切相关，并且所有浓度范围彼此不同[非专利文献1和2]。在实际血浆中，虽然Hcy、Cys和GSH的总浓度(总氧化和还原量)分别在6至20μM、150至350μM和4至10μM的范围内，但是由于血浆中的高氧化条件，几乎所有的Hcy和Cys都以氧化形式存在，因此游离形式以非常少的量存在，例如，在Hcy的情况下约为0.2μM或更小，在Cys的情况下约为10μM或更小。类似地，GSH在细胞中也过量(>5mM)存在，但在血浆中通过γ-谷氨酰转移酶等快速转化，因此游离形式仅以2μM或更少的浓度存在。这些生物硫醇的总浓度和游离形式浓度的相对变化主要与包括心血管疾病、神经退行性疾病、癌症、肾功能障碍、糖尿病以及细菌和病毒感染的重大疾病相关[非专利文献3至7]。然而，尽管作为疾病的常见生物标志物的这些主要生物硫醇可用作指示物，可以检测能够早期检测生物体异常反应的指示物，但是由于快速的氧化还原过程，没有有效检测LMW生物硫醇浓度的方法。因此，迄今为止，LMW生物硫醇不能广泛使用。

用于测量LMW生物硫醇水平的大多数常规标准分析方法依赖于高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱(GC-MS)或毛细管电泳(CE)。然而，在这样的分析方法中，存在技术挑战，其中必须还原LMW生物硫醇以仅测量总量，因为体液样品的预处理需要过量时间消耗，和成本问题。虽然多种文献已经公开了在血液样品预处理期间通过添加抗氧化剂和金属离子螯合剂来测量游离LMW生物硫醇[非专利文献8和9]，但即使在这种环境中，也难以精确测量游离LMW生物硫醇的量，因为对于长的分析时间来说游离LMW生物硫醇的氧化非常快。

作为测量LMW生物硫醇的另一种方法，已经广泛使用市售的基于抗体的免疫分析试剂盒，但是本文使用的所有抗体均不直接识别游离的LMW生物硫醇，而是识别氧化的生物硫醇与蛋白质(例如，在血液的情况下，为血清白蛋白)结合的形式。因此，存在一个限制，即不能检测到游离LMW生物硫醇和总LMW生物硫醇的动态变化。