[发明专利]AXMI669和AXMI991毒素基因及其使用方法

说明书

本发明提供赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀农害活性的组合物和方法。提供包含毒素多肽的编码序列的组合物。编码序列可用于DNA构建体或表达盒中，用于在植物和细菌中转化和表达。组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。特别地，提供分离的毒素核酸分子。另外，包括多核苷酸相应的氨基酸序列，以及特异性结合那些氨基酸序列的抗体。特别地，本发明提供分离的核酸分子，其包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，以及其变体和片段。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年11月23日提交的美国临时申请系列号62/425,669和2016年11月23日提交的美国临时申请系列号62/425,729的权益，其内容通过引用整体并入本文。

参考电子提交的序列表

序列表的官方副本作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web以电子方式提交，其文件名为“APA16-6008WOSEQLIST.txt”，创建于2017年10月3日，大小为30kb，并与说明书同时提交。该ASCII格式的文档中包含的序列表是说明书的一部分，并且通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。本发明提供了编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白和编码它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂和生产转基因抗虫植物中。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是形成革兰氏阳性孢子的土壤细菌，特征在于其能够产生对某些目和种的昆虫特别有毒的结晶包涵体，但对植物和其他非靶标生物体无害。由于该原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或其杀虫蛋白的组合物可用作环境可接受的杀虫剂以控制农业农害或用于各种人或动物疾病的昆虫载体。

来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)主要对鳞翅目(Lepidopteran)、半翅目(Hemipteran)、双翅目(Dipteran)和鞘翅目(Coleopteran)幼虫具有有效的杀虫活性。这些蛋白还显示出对膜翅目(Hymenoptera)，同翅目(Homoptera)、虱毛目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和壁虱目(Acari)害虫的活性，以及对其他无脊椎动物目，如线虫(Nemathelminthes)、扁虫(Plaiyhelminthes)和肉鞭虫(Sarcomastigorphora)的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis familytree.In Advanced Engineered Pesticides,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)。这些蛋白最初主要基于其杀虫活性被分类为CryI至CryV。主要类别是鳞翅目特异的(I)、鳞翅目和双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)和线虫特异的(V)和(VI)。这些蛋白进一步分为亚科；每个科中更高度相关的蛋白被指定了分类字母，如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。每个分类中甚至更密切相关的蛋白被命名为如Cry1C1、Cry1C2等。

基于氨基酸序列同源性而非昆虫靶标特异性描述了Cry基因的命名法(Crickmore等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)。在该分类中，为每种毒素指定唯一名称，其包括第一等级(阿拉伯数字)、第二等级(大写字母)、第三等级(小写字母)和第四等级(另一阿拉伯数字)。罗马数字被替换为第一等级中的阿拉伯数字。具有低于45％序列同一性的蛋白具有不同的第一等级，第二和第三等级的标准分别为78％和95％。

晶体蛋白在被昆虫中肠摄入和溶解之前不会表现出杀虫活性。摄入的原毒素被昆虫消化道中的蛋白酶水解成活性毒性分子(Hofte and Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53:242-255)。该毒素与靶幼虫中肠中的顶端刷状缘受体结合，插入顶膜形成离子通道或孔，导致幼虫死亡。