[发明专利]用于活的功能性组织库的大体积组织样品的无冰保存

说明书

通过将细胞材料与含有至少一种糖的冷冻保护剂制剂/培养基/溶液组合，然后使细胞材料经受玻璃化保存方案，可以保存大体积细胞材料。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月20日提交的美国临时申请号62/436,642的权益。在先申请的公开内容均通过引用其全部内容纳入本文。

技术领域

本发明涉及细胞、组织和器官保存领域，具体涉及包含糖，例如二糖(例如，海藻糖和蔗糖)的新的无冰制剂(例如，用于玻璃化)，以及改善样品材料性质和生物学活力的方案，即使样品体积增加到大于4mL。更具体地，本发明涉及一种采用糖，例如二糖(例如，海藻糖和蔗糖)补充含有细胞材料(例如，体积大于4mL，例如大于10mL)的大样品的无冰玻璃化制剂的方法，以增强保存后的细胞存活和组织功能。

背景技术

无冰冷冻保存的常规方法已成功用于储存相对小的样品规模。例如，人卵母细胞储存已经彻底改变了临床体外受精实践。

为了保存细胞或组织，通常使用冷冻保护剂溶液来防止在冷却或解冻/升温过程中由于冷冻而造成的损害。为了使冷冻保存有用，保存的样品应保持其完整性和/或活力至保存后的合理水平。因此，保存样品的过程应该避免和/或限制细胞和/或组织结构的损害或破坏。

玻璃化，以“玻璃状”而不是结晶相被冷冻保存，是组织库和再生医学的重要使能方法，提供储存和运输细胞、组织和器官的能力，用于各种生物医学用途。在通过玻璃化进行的无冰冷冻保存中，通过存在称为冷冻保护剂的高浓度化学物质来防止冰的形成，所述化学物质与水相互作用并取代水，因此防止水分子形成冰。该方法基本上停止了在冷冻保护剂制剂玻璃化转变温度(Tg)以下的储存期间的生物学时间，并且成功地用于维持小规模细胞和薄组织样品的活力和功能，但是由于扩散(热和质量传递)和相转变限制而排除在大型体系如器官和大组织中的使用。虽然采用传统的边界对流加温技术的先前的玻璃化技术(以及与其一起使用的冷冻保护剂，例如DSMO)有时可以成功地用于4-5mL的样品，但是当样品体积接近10mL时仍会发生结冰，因为传统的边界对流加温技术不能提供足够快的加温速度。冰的形成导致细胞和组织的破坏。玻璃化对大组织样品的主要限制是潜在的细胞毒性，这是由于长期暴露于所用的冷冻保护剂和复温期间的冰形成。

发明概述

发现用糖，例如二糖(例如，海藻糖和/或蔗糖)补充无冰玻璃化制剂用于大体积细胞材料(例如，体积大于4mL，例如大于10mL)，使得保存后的细胞存活和组织功能增加。

因此，本申请提供了用于处理大体积细胞材料的新方法和新制剂，包括将糖，例如二糖(例如，海藻糖和/或蔗糖)添加到无冰玻璃化冷冻保护剂制剂中。补充这些糖可以降低冷冻保护剂引起的细胞毒性和冷却过程及最重要的复温期间形成冰的风险。

附图说明

图1显示了关于无冰冷冻保存制剂补充实验获得的数据，其中将二糖(海藻糖和蔗糖)加入到各种玻璃化制剂(VS49，DP6和VS55)中。

图2显示了关于新鲜和玻璃化兔颈动脉，(上)去甲肾上腺素和去氧肾上腺素(下)剂量反应曲线的收缩反应获得的数据。

图3显示了关于在猪股动脉上比较VS55±0.6M蔗糖的4和10mL样品(alamarBlue测定)获得的数据。

图4显示了关于在预收缩(生理学测定)后由硝普钠引起的猪平滑肌松弛获得的数据。

图5显示了关于兔胸主动脉样品获得的数据，所述兔胸主动脉样品在含有或不含有0.6M蔗糖、有或没有纳米颗粒的30mL体积的VS55中玻璃化，用于比较对流与纳米加温(nanowarming)。