[发明专利]热稳定性提高的phi29 DNA聚合酶突变体

说明书

提供了热稳定性提高的phi29 DNA聚合酶突变体，制备该突变体的方法，该突变体的应用以及提高phi29 DNA聚合酶稳定性的方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及热稳定性提高的phi29 DNA聚合酶突变体。

背景技术

phi29 DNA聚合酶是从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体phi29中克隆得到的嗜温DNA聚合酶。它是分子量大小为66kDa的单体蛋白，具有两个结构域：一个是位于N-端的具有3’→5’外切活性结构域，一个是位于C-端的DNA复制起始及聚合活性结构域。phi29 DNA聚合酶具有诸多特性，如较强的持续合成能力，较好的校正活性，等温扩增特性，链置换功能，较好的扩增覆盖度以及无偏差的扩增等。因此，它已被广泛应用于多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)、滚环复制(rolling cycleamplification，RCA)和双向测序(pair-end sequencing)，以及单细胞测序等领域。然而该酶的嗜温特性决定了其稳定性差的缺点，从而导致phi29 DNA聚合酶较短的储存周期，且大大提高了其生产、储存和运输成本。

为了克服phi29 DNA聚合酶稳定性差的缺点，现有技术中的解决方法及其缺点如下：

1)4℃冷库或层析柜纯化phi29 DNA聚合酶，缺点：制备成本高，操作过程严苛；

2)phi29 DNA聚合酶于储存溶液中置于-20℃/-80℃储存，缺点：低温储存仅能暂时保持其活性稳定，但随时间的延长，活性逐渐降低；

3)phi29 DNA聚合酶与反应混合液储存于试剂盒，缺点：虽有利于客户操作使用，但较phi29 DNA聚合酶单独储存，该条件下酶的稳定性更差；

4)改良phi29储存溶液成分，如添加海藻糖和BSA等，缺点：在酶浓度较低时，添加剂或有帮助，但在酶浓度高时，添加剂帮助不明显，不能从根本上解决问题。

发明公开

本发明所要解决的技术问题如何提高phi29 DNA聚合酶的稳定性。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质为如下(1)-(17)中的任一种：

(1)将phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列的第239位氨基酸由谷氨酸突变为色氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；

(2)将phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列的第217位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；

(3)将phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列的第224位氨基酸由酪氨酸突变为赖氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；

(4)将phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列的第526位氨基酸由苯丙氨酸突变为赖氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；

(5)将phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列的第171位氨基酸由谷氨酰胺突变为谷氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；

(6)将phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列的第470位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；

(7)将phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列的第217位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；

(8)将phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列的第216位氨基酸由亮氨酸突变为赖氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；