[发明专利]用于动物胚胎碱基编辑的组合物和碱基编辑方法

说明书

本发明提供一种包含脱氨酶和靶特异性核酸酶的碱基编辑组合物、使用该碱基编辑组合物的碱基编辑方法，以及生产经遗传修饰动物的方法。该碱基编辑组合物在哺乳动物胚胎中具有碱基编辑活性。

技术领域

本发明提供一种包含脱氨酶和靶特异性核酸酶的碱基编辑组合物，使用该碱基编辑组合物的碱基编辑方法，以及构建经遗传修饰动物的方法。

背景技术

大多数人类遗传疾病是由单碱基取代或点突变，而不是基因组中的一些插入/缺失(插入缺失)或广泛的染色体重排引起的。由可编程核酸酶(诸如簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)-Cas9或Cpf1系统)介导的基因组编辑能够对引起遗传疾病的遗传缺陷进行基因校正，但是在以靶特异性方式诱导单碱基取代方面存在技术困难。这是因为可编程核酸酶产生的大多数DNA双链断裂(DSB)通过易错非同源末端连接(NHEJ)而不是使用模板供体DNA的同源重组(HR)来修复。因此，核酸酶靶向位点的插入缺失比单核苷酸取代更频繁地发生。

最近，据报道与胞苷脱氨酶(诸如载脂蛋白B编辑复合物1(APOBEC1)或活化诱导脱氨酶(AID))连接的Cas9切口酶(nCas9)或催化缺陷型Cas9(dCas9)在靶位点用C取代T(或用G取代A)，而不会产生DSB。这些报道显示了在酵母和经培养的哺乳动物细胞中的碱基编辑。这些RNA引导的可编程脱氨酶将基因组编辑的覆盖范围扩展到另一个水平，并且可能提出一种在包括人类在内的所有生物中诱导靶突变或进行基因编辑的方法。然而，必须证明RNA可编程脱氨酶在体内具有碱基编辑功能。

发明内容

技术问题

本发明提供了通过使用可编程脱氨酶在诸如鼠细胞的真核细胞(例如，包括哺乳动物细胞的动物细胞)中诱导单核苷酸取代的技术。

一个实施方案提供了碱基编辑组合物，其包含：(1)脱氨酶或其编码基因，和(2)靶特异性核酸酶或其编码基因。细胞可以是真核细胞(例如，来自真核动物的细胞)，并且碱基编辑方法可以在真核细胞中进行碱基编辑(例如，碱基取代)。

靶特异性核酸酶可包括：RNA引导的核酸酶；以及可与靶基因或其编码DNA(或携带编码DNA的重组载体)中的靶位点杂交(具有互补核苷酸序列)的向导RNA。在这方面，碱基编辑组合物可包含：(1)脱氨酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)、(2)RNA引导的核酸酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)，和(3)向导RNA或其编码基因(DNA)。

除了(1)脱氨酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)、(2)RNA引导的核酸酶或其编码基因(mRNA或携带编码DNA的重组载体)，和(3)向导RNA或其编码基因(DNA)之外，碱基编辑组合物可以进一步包含：(4)尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)或其编码基因；和/或(5)核定位序列(NLS)或其编码基因。在碱基编辑组合物使用脱氨酶、RNA引导的核酸酶和可选地UGI和/或NLS或其编码基因分别连接的融合蛋白或基因形式的情况下，可以在相邻的偶联蛋白质或基因之间给予合适的接头，例如，脱氨酶和RNA引导的核酸酶之间、核酸酶和UGI之间，以及UGI和NLS(融合蛋白的肽接头(3-30或3-20a.a.)和融合基因的寡核苷酸接头(9-90或9-60nt))。

另一个实施方案提供了一种碱基编辑方法，包括将碱基编辑组合物引入细胞的步骤。细胞可以是真核细胞，并且碱基编辑方法可以在真核细胞中进行编辑(例如，碱基取代)。

在一个实施方案中，将碱基编辑组合物引入细胞的步骤可以通过以下进行：

1)通过分别携带这些基因或携带至少两个基因的重组载体将编码脱氨酶的DNA、编码RNA引导的核酸酶的DNA和编码向导RNA的基因转染到细胞中，

2)将脱氨酶、RNA引导的核酸酶和向导RNA(例如，脱氨酶、RNA引导的核酸酶和向导RNA复合的核糖核酸蛋白)直接注射到细胞中，或者