[发明专利]提高细胞基因组中同源定向修复(HDR)效率的方法

说明书

在某些实施方案中，本公开文本提供了用于提高细胞基因组中同源定向修复(HDR)效率的方法，其包括：(a)向所述细胞中引入：(i)核酸酶；和(ii)供体核酸，其包括有待插入基因组中的修饰序列；并且(b)使所述细胞经受从37℃到更低温度的温度转变；其中所述核酸酶在所述细胞中的切割位点切割基因组，并且所述供体核酸通过提高的HDR率引导用所述修饰序列修复基因组序列。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年12月20日提交的美国临时申请号62/437,042的权益，出于所有目的将所述申请以其全文特此结合。

背景技术

本领域已经描述了用于基因组序列的DNA靶向切割的各种方法。此类靶向切割事件可用于诱导靶向诱变，诱导细胞DNA序列的靶向缺失，并促进在预定染色体基因座处的靶向重组。这些方法通常涉及使用工程化切割系统在靶DNA序列中诱导双链断裂(DSB)或切口，使得通过错误产生的过程(例如非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR))而对断裂的修复可以导致基因失活或外源目的序列的插入。通过如下方式可以发生切割：通过使用特异性核酸酶例如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)，使用CRISPR/Cas系统与工程化单一指导RNA(sgRNA)来指导特异性切割。

通过HDR过程在特定靶位置处的基因组修饰的效率在细胞中相对较低。因此，仍然需要提高细胞基因组中同源定向修复(HDR)效率的方法。

发明内容

在某些实施方案中，本发明提供了用于提高细胞基因组中同源定向修复(HDR)效率的方法，其包括：(a)向所述细胞中引入：(i)核酸酶；和(ii)供体核酸，其包括有待插入基因组中的修饰序列；并且(b)使所述细胞经受从37℃到更低温度的温度转变；其中所述核酸酶在所述细胞中的切割位点切割基因组，并且所述供体核酸通过提高的HDR率引导用所述修饰序列修复基因组序列。例如，同源定向修复(HDR)率提高了至少1.5倍。任选地，同源定向修复(HDR)率提高了至少2倍。

在某些方面，更低温度在28℃与35℃之间。任选地，更低温度在30℃至33℃之间。例如，细胞在更低温度下生长至少24小时或至少48小时，例如1天与5天之间(1天、2天、3天、4天或5天)。任选地，在温度转变后，细胞在37℃下生长。

在某些方面，细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。在一个具体实施方案中，细胞是干细胞，例如诱导多能干细胞(iPSC)。在另一个具体实施方案中，细胞是原代细胞。

在某些方面，本发明中使用的核酸酶包括所有DNA序列特异性核酸内切酶或RNA指导的DNA核酸内切酶。任选地，核酸酶是选自Cas核酸酶或Cpf1核酸酶的CRISPR核酸酶。例如，核酸酶是Cas9核酸酶。为了说明，将CRISPR核酸酶(例如Cas9)与DNA形式的sgRNA(例如编码Cas9核酸酶和sgRNA的DNA)或RNA形式的sgRNA(例如sgRNA/Cas9RNP或sgRNA/Cas9mRNA)一起引入细胞中。任选地，sgRNA是合成的并且是经化学修饰的。在某些方面，供体核酸含有对称同源臂。任选地，供体核酸与基因组中的DNA链互补，所述DNA链被核酸酶切割。

在某些方面，本发明中使用的核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。在某些其他方面，本发明中使用的核酸酶是TALE核酸酶(TALEN)。

在某些实施方案中，本发明提供了通过上述方法产生的分离的细胞。

在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含通过上述方法产生的分离的细胞。

在某些实施方案中，本发明提供了向有需要的受试者提供目的蛋白质的方法，所述方法包括：(a)根据上述方法将编码目的蛋白质的供体核酸引入细胞中；并且(b)将细胞引入受试者中，使得目的蛋白质在受试者中表达。