[发明专利]特异性识别甲基化修饰DNA碱基的TALE RVD及其应用

说明书

本发明提供了对于5mC、5hmC和6mA具有识别偏好和不同结合特性的RVD，以及包含含有上述RVD的TALE重复结构域的分离的DNA结合多肽、融合蛋白、其编码多核苷酸、包含多核苷酸的载体以及宿主细胞。本发明还提供上述DNA结合多肽、融合蛋白在甲基化依赖的基因激活、高效基因组编辑、检测目标基因靶序列中的甲基化碱基以及靶向结合细胞中目标基因中的应用。

本发明涉及使用DNA结合蛋白对基因进行调节、编辑和检测的技术。

背景技术

转录激活样效应因子(transcription activator-like effector，TALE)是来自植物致病菌黄单胞菌属(Xanthomonas)的毒力因子，能够对真核基因组进行再编程(reprogram)(1，2)。TALE含有DNA结合域，该DNA结合域由可变数量的串联重复单元组成(3)。每个重复包含33-35个氨基酸残基的共有序列(consensus sequence)，除了在第12位和第13位具有两个高度可变的氨基酸(重复可变的双残基，repeat-variable diresidues或RVD)(4，5)。TALE蛋白对DNA的识别由串联重复单元介导，串联重复单元通过其RVD靶向核苷酸，以序列特异性的方式结合DNA，RVD决定了核苷酸特异性(4，6)。RVDs与DNA碱基形成直接的、序列特异性的接触通过模块化的DNA识别特性，TALE可以与功能域，如转录激活因子(7，8)、转录抑制因子(9，10)或核酸内切酶(11，12)等融合，称为可编程的基因编辑工具。已有的研究中使用实验方法和计算方法对RVD-DNA识别密码进行了部分解码(4，6)；发现最常用的四个RVD(NI、NG、HD和NN)分别优先结合A、T、C和G/A(4，6)。

除了四种常规脱氧核糖核苷酸之外，哺乳动物基因组还含有修饰的DNA碱基。例如，5-甲基胞嘧啶(5mC)，它被称为是第五种DNA碱基，是一种重要的表观标志物，调节基因表达(图1)(15，16)。5mC可以相继被10-11易位酶(TET)家族蛋白氧化，产生5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，后二者是胸腺嘧啶DNA糖基化酶的底物，并最终恢复为未修饰的胞嘧啶(17，22)。5hmC组成～1％-10％的修饰的胞嘧啶，并被认为是一种稳定的表观标记；在癌症中经常观察到5hmC的调节异常。

除了胞嘧啶上的甲基化修饰以外，另一种常见的DNA甲基化修饰N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenine，6mA)作为DNA的腺嘌呤上的一种共价修饰在原核细胞中发挥重要作用，参与调节多种生物途径，包括作为限制修饰系统(restriction-modification，RM)的一部分抵御外源DNA入侵，在DNA复制、错配修复、基因转录和转座等过程中起调控作用等(41，47)。而6mA在真核生物中的相关研究比较少，同时对6mA在表观遗传中的作用也不十分清楚(46)。

2015年在Cell杂志上的三篇文章报道了在衣藻、线虫和果蝇等真核生物的基因组中的6mA(42，43，48)。对于衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中6-甲基胞嘧啶位置的测定，发现衣藻的大部分基因中都有6mA分布，并且多数是以ApT双碱基模式出现；同时6mA在转录起始位点富集，与基因活跃表达相关(42)。而在果蝇(Drosophila melanogaster)和线虫(Caenorhabditis elegans)的研究中则发现6mA很可能在分化和发育过程中起到重要的调控作用(48)。人们发现6mA甲基化和去甲基化相关的酶在进化中是保守的，所以6mA很可能在其他真核生物中也有分布(43)。直至2016年，Koziol等人证实了6mA在脊椎动物基因组中的存在，其中包括了非洲爪蟾(Xenopus laevis)的不同组织以及小鼠与人的组织或细胞系。6mA修饰在脊椎动物中丰度很低，研究发现与衣藻和果蝇不同，爪蟾与小鼠基因组中的6mA广泛分布于除外显子以外的区域，同时也表现出一定的序列基序规律，说明6mA修饰在不同真核生物中可能有不同的功能(44)。6mA这种表观遗传修饰在高等生物中的分布及其在细胞与个体发育等过程中的作用和机制还有待深入研究。