[发明专利]亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体属于一种将高毒亚硒酸钠脱毒转化为低毒生物硒的微生物发酵方法。

背景技术

硒是人体生命活动中不可缺少的一种微量元素。已有研究表明，硒具有抗氧化、提高机体免疫水平、缓解重金属毒性、抗衰老、防癌抗肿瘤、抗心脑血管疾病等重要的生理作用。人体内硒的总积聚量约15 mg，在摄入与排泄中保持动态平衡，联合国卫生组织指出，膳食摄取硒是最理想的补硒方式，天然食物中的硒含量普遍较低，果蔬中硒含量一般小于10 μg/kg。我国营养学会推荐正常成人摄入硒的安全和合适范围为 50-250 μg/d。调查表明，在我国大约有72%的国土呈现出不同程度的缺硒情况，缺硒问题十分严峻，对于广大硒缺乏人群而言，补充硒元素对于预防和辅助治疗硒缺乏相关疾病以及提高人体免疫力有着重要的现实意义。

目前，广泛使用的补硒方法是添加无机补硒剂，如亚硒酸钠、亚硒酸氢钠、硒酸钠等。无机硒已成功用于克山病、大骨节病等地方病的防治。但是，应用效果证明亚硒酸钠等无机硒毒性大，活性和毒性范围窄，最低致死量相对较小，利用率相对较低，安全性方面存在较大隐患。因此，通过脱毒转化作用，将亚硒酸钠的毒性大幅减低，并开发新型、保健、低毒、安全的生物硒已经成为目前硒添加剂制备的发展趋势。

发明内容

针对目前常用补硒剂亚硒酸钠毒性高、半数致死量小的问题，本发明提供一种将高毒亚硒酸钠脱毒转化为低毒生物硒的微生物发酵方法。

本发明利用微生物菌株，通过该微生物发酵作用将高毒的亚硒酸钠脱毒转化为没有毒性的生物硒，此方法可用于制备高效安全的硒添加剂。

本发明所述的微生物菌株，是从市售的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）经过长期选育得到，其将亚硒酸钠脱毒转化的效率较高。该菌株已于2014年8月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 ：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为 CGMCC No. 9507。

本发明利用保藏号为CGMCC No. 9507的酿酒酵母，在培养基中加入亚硒酸钠，通过酿酒酵母自身的生长代谢繁殖，将原料中添加的高毒亚硒酸钠脱毒转化成生物有机硒。本发明利用微生物发酵技术可以将高毒的亚硒酸钠脱毒转化为毒性较低、安全系数更高的天然生物硒添加剂。

本发明提供一种利用选育的微生物菌株，通过其自身的生长代谢将高毒亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，具体包括如下步骤：

（1）菌悬液的制备

挑取一环已活化两到三次的微生物菌种于5 mL液体培养基中，置于28℃摇床培养24 h后成为菌体培养液，取200 μL菌体培养液加入液体培养基中，在28 ℃摇床培养24 h成为菌悬液，再从培养好的菌悬液中取2 mL加入到无菌水中，在28 ℃摇床培养，菌液浓度达10⁷cfu/mL时停止培养。

（2）亚硒酸钠脱毒转化发酵条件的优化

选择硒添加量、培养温度、培养时间、初始pH、接种量、装液量六个因素进行Plackett-Burman试验，研究影响亚硒酸钠脱毒转化的主要因素；采用单因素试验和最陡爬坡试验确定各主要因素水平；采用三因素三水平的响应面试验，研究酿酒酵母的亚硒酸钠脱毒转化的发酵条件，得出亚硒酸钠脱毒转化的最佳发酵条件为亚硒酸钠添加量81.3 mg/L、初始 pH 6.3、培养温度28.6℃，发酵时间30天。

（3）生物硒的分离与纯化

将经过脱毒转化发酵的生物发酵液经过超声破碎后全部装入透析袋MD34（8000-14000）内，扎紧上端，于蒸馏水中透析得到亚硒酸钠脱毒转化之后的生物硒样品液。

（4）硒含量测定

采用氢化物-火焰原子吸收法测定透析内生物有机硒样品液中硒含量，测得样品液中生物有机硒含量为1.52 mg/kg（以硒计）。

（5）生物硒和亚硒酸钠的急性毒性试验结果对比

试验选用6～8周龄，体重18～20 g的昆明种小白鼠60只，采用改良寇氏法，采用一定浓度的亚硒酸钠溶液和生物硒进行灌胃实验。一次经口灌胃。经口灌胃后，对小白鼠进行观测，记录日常行为、群体行为、毒性表现情况以及死亡情况，观测的周期为两周并记录其异常表现以及死亡状况。

根据公式计算半数致死量LD₅₀：

i为组距（相邻两试验组的对数的差）；

X_m为最大剂量对数；