[发明专利]一种使用透明质酸包裹的金纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法

说明书

本发明公开了使用透明质酸包裹的金纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法，包括如下步骤：A、将金纳米粒子充分分散于透明质酸胶体水溶液中，然后对混合物进行冷冻喷雾干燥，得到分散的表面包覆有透明质酸水凝胶的金纳米粒子，即为所述透明质酸包裹的金纳米粒子；B、使待测细胞摄入所述透明质酸包裹的金纳米粒子；摄入后该透明质酸包裹的金纳米粒子以催化发夹组装方法与mRNA结合并进而通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA‑DNA，其可发荧光；C、向包含受试细胞的样品溶液中加入电子烟烟雾萃取液，然后在暴露于烟气捕集物之前和之后，分别测定细胞发出的荧光强度，根据二者比例确定细胞凋亡率，进而评价烟气暴露对细胞的损伤程度。

技术领域

本发明属于生物检测方法领域。

背景技术

人们抽吸烟草制品发出的烟雾时，呼吸道细胞会因直接暴露于烟气而受到不同程度的损伤。烟草企业一直在努力对烟草进行减害化处理以便减少这种损伤。已经开发出了各种减害化方法，为了评价减害效果的优劣，需要有一种评价烟气暴露对细胞损伤的方法，最好是定量化方法。

传统方法是取人体呼吸道细胞(例如人肺泡II型上皮细胞系A549细胞)使之暴露于烟气，通过检测烟气暴露后凋亡细胞的数量，来评价烟气暴露对细胞的损伤程度。该方法中需要使用荧光染色剂对细胞DNA进行染色，进而对活体细胞数量进行分析。但荧光染色剂会破坏细胞的活性并导致细胞内毒素的产生，这就可能对电子烟烟雾细胞暴露的结果进行干扰，影响了评价结果的准确性。

为此，需要提出更好的评价烟气暴露对细胞损伤的方法。

发明内容

本发明提供了一种使用透明质酸包裹的金纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法，包括如下步骤：

A、将金纳米金粒子充分分散于透明质酸胶体水溶液中，然后对混合物进行冷冻喷雾干燥，得到分散的表面包覆有透明质酸水凝胶的金纳米粒子，即为所述透明质酸包裹的金纳米粒子；

B、使待测细胞摄入所述透明质酸包裹的金纳米粒子；摄入后该透明质酸包裹的金纳米粒子以催化发夹组装方法与mRNA结合，结合有该透明质酸包裹的金纳米粒子的mRNA通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA-DNA，形成可在外界光辐射作用下发荧光的细胞；

C、向包含受试细胞的样品溶液中加入上述透明质酸包裹的金纳米粒子并静置足够长时间，然后在暴露于烟气捕集物之前和之后，分别在光辐射下测定细胞发出的荧光强度，根据二者比例确定烟气暴露前后的细胞凋亡率，进而评价烟气暴露对细胞的损伤程度。

各步骤具体如下：

A、复合纳米金的制备

本发明选用金纳米粒子作为载体与高分子材料进行结合制备无损细胞的金纳米粒子复合物，纳米金颗粒具有典型的纳米材料特性，即较大的比表面积，表面布满阶梯状结构，这种结构具有高表面能的不安定原子，即有许多不饱和化学键，这提供了较多的吸附位点与作用位点，极易同外来分子通过化学键结合。同时金纳米粒子本身具有荧光介质的属性可在基因检测中提供荧光，避免使用化学荧光剂带来的细胞毒性，使用本发明可以实现细胞目标基因的无损检测。

使用原位合成法，通过三维复合搅拌技术将透明质酸水凝胶高分子网络体系与纳米金粒子充分均匀混合，制备成纳米金粒子透明质酸复合物，并形成稳定的配位化合物。

具体合成步骤如下：在室温光催化条件下，使用纳米金颗粒与透明质酸水凝胶进行三维混合搅拌，混合搅拌速度90转/分钟。使用扫描电镜表征透明质酸水凝胶与金纳米颗粒的结合程度。待纳米金颗粒在透明质酸水凝胶中达到均匀分散即可停止搅拌。得到均匀稳定的纳米金/透明质酸水凝胶复合物后对其进行冷冻干燥处理，最终得到纳米金/透明质酸复合物颗粒，见图1。

B、纳米金/透明质酸复合物组装