[发明专利]一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及方法

权利要求书

1.一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统包括物镜及成像透镜、照明模块、成像模块及三维纳米级样品锁定模块；所述的照明模块用于实现三通道宽场及半全内反射照明，全内反射照明，且照明方式能够调节；由照明模块产生的照明光通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；样品发射出的荧光通过第一多色反射镜及前成像透镜后，由一块分配反射镜进行分配，其中一部分分配到三维纳米级样品锁定模块中，另一部分分配到成像模块中；所述的三维纳米级样品锁定模块在超高图像拍摄过程中锁定样品位置，所述的成像模块将第一通道，第二通道和第三通道产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上；

所述的三维纳米级样品锁定模块采用与三通道照明光源不相同的发光二极管作为明场光源，通过科勒照明光路照射在样品上，通过显微镜主体后一部分的明场光在锁定相机上成像，在所述的分配反射镜与锁定相机之间设置有第四滤镜；所述的三维纳米级样品锁定模块利用与三通道照明光源不相同的发光二极管通过科勒照明光路为样品提供明场照明；物镜从样品处接受的光被分配分光镜分配，其中一部分的光经过前成像透镜成像于锁定相机；锁定相机与计算机连接，当计算机的程序启动时，程序会先从锁定相机中抓取实时图像，程序会实时计算出图象局域对比度，选取最优区域，以局域对比度之和最大的区域作为最优区域的位置；所述的三维纳米级样品锁定模块还包括压电陶瓷平台，开始锁定时，锁定程序会通过压电陶瓷平台驱动控制压电陶瓷平台，在纵向上焦面上下进行扫描；在扫描时从锁定相机中抓取标定图像序列，并记录相应z值；锁定程序从标定图像序列最上端或最下端图像以最优区域位置截取固定大小的区域作为参照图像；对序列的图像与参照图像求空间相关性矩阵，并对空间相关性矩阵进行高斯拟合；求出拟合峰值与z值的单调递减对应关系并用多次函数近似拟合；锁定程序随后从锁定相机中实时抓取样品的明场图像；对实时图像与参照图像求空间相关性矩阵并进行高斯拟合，求出中心位置作为x，y平面上的偏移量，并通过拟合极值求出实时的z值；锁定程序随后通过驱动电路驱动压电陶瓷平台以补偿偏移。

2.如权利要求1所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，所述的照明模块中的第一通道及第二通道激发的激光经过第一准直透镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；照明模块中的第三通道激发的激光经过第二准直透镜、反射镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上。

3.如权利要求1所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，所述的成像模块包括矩形光阑、成像准直透镜、三个不同的光路、反射镜组、后成像透镜和EMCCD或sCMOS相机的探测器，三个不同的光路中的第一光路包括第一双色反射镜和第一滤镜；第二光路包括第二双色反射镜和第二滤镜；第三光路包括第三双色反射镜和第三滤镜。

4.如权利要求3所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，标记样品结构的荧光染料受到激光激发产生的荧光由物镜采集，通过分配反射镜进行配比，其中一部分进入到所述的成像模块的三通道荧光同时成像光路，到达成像模块的荧光首先通过一个矩形光阑对成像范围进行调节，并通过成像准直透镜对荧光进行准直，变为平行光，此时的荧光为三个通道的荧光混杂在一起，第一双色反射镜、第二双色反射镜和第三双色反射镜将第一通道，第二通道和第三通道产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，每个通道的光路中都有一个滤镜，包括第一光路中的第一滤镜、第二光路中的第二滤镜和第三光路中的第三滤镜，第一滤镜、第二滤镜和第三滤镜用于滤除通道中的激发光，剩余的荧光部分通过反射镜组调节方向，并最终通过后成像透镜，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上；在超分辨率成像过程中，第一通道，第二通道，及第三通道的照明光同时照射在样品上，当照明光强较强时，标记样品的三个通道的荧光染料会同时“闪烁”，经过成像模块，分别成像在探测器的不同部分，探测器会采集几千到几万张带有荧光染料“闪烁”信号的原始图像，并传输到计算机中，计算机通过高斯拟合，找出每一张原始图像中每一个闪烁点的中心位置，并将所有原始图像的闪烁点中心位置叠加在一起，得到三个通道的超高分辨率图像。