[发明专利]人类MTHFR基因多态性检测试剂盒

权利要求书

1.用于同时检测人类 MTHFR基因C677T位点和A1298C位点多态性的试剂盒，其特征在于设有盒体、内衬、PCR 混合液管、酶混合液管、阳性对照管和阴性对照管，内衬设在盒体内，PCR混合液管、酶混合液管、阳性对照管和阴性对照管分别插入内衬的孔内；PCR混合液管内装有PCR混合液，酶混合液管内装有酶混合液，阳性对照管内装有阳性标准对照品，阴性对照管内装有阴性标准对照品。

2.根据1权利要求所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包含1×PCR反应液，3.0mM MgCl₂，dATP、dCTP、dGTP、dUTP、dTTP各0.2mM，各条探针0.2μM，各条引物0.4μM；所述酶混合液包括5μ/μL Taq DNA聚合酶、0.1μ/μL μNG 酶。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有2组特异性引物序列，所述特异性引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.1-6 所示。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还含有2组特异性探针，所述2组特异性探针的核苷酸序列分别为 SEQ ID NO:7 与 SEQ ID NO:8，SEQ IDNO:9 与 SEQ ID NO:10，且所述特异性探针的 5’端修饰分别为FAM 与 HEX，Cy3与Cy5，3’端修饰有 NFQ-MGB。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括内标系统，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12所示，所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:13 所示。

6.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述内标探针5’端修饰为ROX，3’端修饰有 NFQ-MGB。

7.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括两条低退火温度的富集引物，分别用于富集C677T位点和A1298C位点的模板，所述富集引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.14 和SEQ ID NO:15所示。

8.根据权利要求1-7 中任意一项所述的试剂盒同时检测 MTHFR基因C677T位点和A1298C位点多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）获得待测样品基因组DNA；

（2）利用所述特异性引物、特异性探针、内标系统、富集引物、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶等进行荧光定量PCR反应，单管反应即可同时检测每个样品的MTHFR基因C677T位点和A1298C多态性。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的体系为：

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述荧光定量 PCR扩增程序为：

第一步：50℃ 2min，95℃ 10min ；

第二步：95℃ 15s，45℃～55℃ 1min，5个循环；

第三步：95℃ 15s，58℃～62℃ 1min，40个循环；

且在第三阶段58℃～62℃时采集探针所对应通道 FAM、HEX、Cy3、Cy5、ROX 的荧光信号；

程序运行完毕，将PCR薄壁反应管或八联管取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。