[发明专利]一种葡萄糖异构酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种葡萄糖异构酶突变体及催化D‑葡萄糖异构化制备D‑果糖中的应用，本发明由Thermus oshimai GI(ToGI)的基因序列为模板,经三位点的定点突变后，ToGI突变体以质粒pET‑28b或能表达该酶的载体为表达载体，以Escherichia coli BL21(DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现高转化率葡萄糖异构酶基因的高效表达，酶活为8.45U/mg。本发明中所述ToGI突变体具备优良热稳定性，于100℃保温7d，酶活保持不变。运用固定化技术，该催化剂在100℃条件下连续催化400g/L D‑葡萄糖生成D‑果糖的15个批次中，转化率均大于60％。

(一)技术领域

本发明涉及一种葡萄糖异构酶突变体，具体地说涉及利用基因突变技术获得的具有超级高温热稳定性的葡萄糖异构酶突变体的方法，以及该固定化葡萄糖异构酶突变体在超高温下连续异构化葡萄糖生产超高D-果糖浓度高果糖浆的应用。

(二)背景技术

葡萄糖异构酶(glucose isomerase，简称GI，EC 5.3.1.5)，在体外主要用于催化D-葡萄糖异构化生成D-果糖，是工业上利用生物转化法制备高果糖浆的关键酶。根据GI的一级结构，可以将其分为两类，即I类和II类酶。与I类GI相比，II类GI的肽链N端含有多余的40-50个氨基酸残基(Deng H.etal.，Bioprocess and Biosystems Engineering，37：1211-1219，2014)。

高果糖浆(high fructose corn syrup，简称HFCS)是D-葡萄糖和D-果糖组成的混合物，是一种重要的甜味剂。高果糖浆具有溶解度高、化学和热稳定性好、渗透压大、吸潮性和保湿性强、与其它添加剂混合不影响食品风味等优势。根据其果糖含量的不同，高果糖浆主要有3种产品：HFCS-42、HFCS-55和HFCS-90。其中，HFCS-55的甜度优于蔗糖，是市场上的主流产品。但是，目前广泛采用的葡萄糖异构酶生物转化工艺无法一步制得F55型高果糖浆，需要将HFCS-42浓缩再与HFCS-90勾兑才能制得HFCS-55(MoellerS.M.et al.，Journalof the American College of Nutrition,28:619-26，2009)。

GI介入的D-葡萄糖异构化过程是一个热力学平衡反应，随着异构化温度的升高，会促进异构化反应向果糖方向进行。目前，商业上用于生产高果糖浆的GI主要来源于Bacillus coagulans、Streptomyces murinus和Streptomyces rubiginosis等野生菌(DicosimoR.et al.，Chemical Society Reviews,42：6437-6474，2013)。由于上述这些GI的耐热性一般，只能在60-65℃的异构化温度稳定地进行催化反应，果糖转化率仅42-45％。因此，如果能在高温如100℃或更高的异构化温度下催化，所生成的具有高于55％D-果糖浓度的高果糖浆将有助于减少后续富集和勾兑的成本，对推进高果糖浆的生产技术变革具有重要意义。

目前，已有一些耐热GI的报道，例如Thermotoga maritima和Thermusthermophiles等，其最适温度分别达到105℃和95℃，但是，这些酶并没有制成酶制剂成功投放于市场，主要原因是该耐高温酶在高温的热稳定性没有达到工业化生产的要求。鉴于此背景，本发明提出将现有GI进行定点突变以提高其高温热稳定性，并通过基因工程技术构建高表达的基因工程菌，经固定化后用于在高温下连续化、低成本化生产高果糖浆，对于填补缺乏耐高温GI酶制剂的市场空白具有重大意义。

(三)发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种葡萄糖异构酶突变体，提高其高温热稳定性，经固定化后用于在高温下连续化、低成本化生产高果糖浆。

本发明采用的技术方案为：