[发明专利]用于金黄色葡萄球菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种用于金黄色葡萄球菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用。所述检测试剂包括：引物对，包括序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物；以及探针，其序列如SEQ ID NO：1所示。所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端标记有荧光报告基团。本发明使用了可特异性识别致病菌基因序列的扩增探针和引物对，因而具有特异性高、稳定性好的特点，本发明提供的检测方法还具有简单、快速、灵敏的优点。

技术领域

本发明涉及一种革兰氏阳性菌的检测方法，特别涉及一种用于金黄色葡萄球菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

致病菌(Pathogenic bacteria)是指能引起疾病的微生物。致病菌包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌，致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当大一部分可以致病，而条件致病菌只在特定条件下致病，如有伤口可以允许细菌进入血液，或者免疫力降低时。

基于核酸扩增方式的分子检测方法广泛应用于致病菌的检测，其中荧光定量PCR

(Quantitative Real-time PCR，qPCR)通过定量检测微生物DNA来确定微生物数量的一种快速、敏感性高的检测方法，但是该方法存在无法区分微生物死活的弊端。由于死菌的DNA能稳定并长期存在于污染样本中，其同样可以作为扩展模板被核酸扩增方法所检测到。

叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide，PMA)的叠氮基团在光作用下脱去-N2，并嵌入DNA双链发生共价交联。PMA带有正电荷，活细胞完整的细胞膜可以阻止其进入，但可穿入死细胞和膜损伤细胞与DNA进行结合，在光诱导作用下可与其DNA发生不可逆的共价交联。游离的PMA与H2O反应生成羟胺，发生钝化反应，钝化的PMA对DNA无影响。利用PMA这一特性，可以进行活菌检测。

近年来，PMA结合PCR对假阳性PCR结果进行鉴别的技术已有报道，尤其是对革兰氏阴性菌(Li B ,Chen JQ .2012 .Real-time PCR methodology for selective detectionofviable Escherichia coli O157:H7cells by targeting Z3276as a geneticmarker.Appl Environ Microbiol .78(15):5297-5304 .)。而革兰氏阳性菌因细胞壁成分特征，使得PMA进入死菌的效率不高。

目前检测致病菌的常见方法有：平板培养法、信使RNA检测法。但这些方法操作复杂，耗时较长，信使RNA检测具有不稳定性，拷贝数较低，检测灵敏性差，重复性差，同时在提取过程中易被DNA污染，容易造成假阳性或假阴性。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种用于金黄色葡萄球菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用，以克服现有技术的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种检测试剂，包括：

引物对，包括序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物；以及

探针，其序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端标记有荧光报告基团。

本发明实施例还提供了一种试剂盒，包括所述的检测试剂。

进一步的，所述的试剂盒还包括PCR扩增反应所需的辅助试剂、叠氮溴化丙锭、triton x-100。

本发明实施例还提供了一种应用于金黄色葡萄球菌活菌检测方法的产品，包括所述的检测试剂或所述的试剂盒，并且所述的检测方法包括：