[发明专利]一种芽孢杆菌及其用于生产异戊酸的方法

说明书

本发明涉及一种芽孢杆菌及其用于生产异戊酸的方法。该芽孢杆菌（Bacillus）是从醇化中期烟叶上通过选择性培养基分离得到的，已于2017年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14609。该菌株能够以烟草工业废弃物为原料合成异戊酸，该异戊酸为无色黏稠液体，高度稀释后则有甜润的果香，以及笃斯越橘样的香味。在本发明利用芽孢杆菌合成异戊酸的过程中使用的发酵培养基不仅成本低廉，而且可以处理烟草工业产生的大量废弃物，在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌及其应用，特别涉及一株筛选获得的芽孢杆菌及利用该菌株发酵生产异戊酸的方法。

背景技术

异戊酸又称3-甲基丁酸，无色黏稠液体，熔点是-29.3℃，沸点是176.5℃，能与醇、醚、氯仿等互溶。

异戊酸具有刺激性酸败味，高度稀释后则有甜润的果香，以及笃斯越橘样的香味。异戊酸天然存于缬草油、香草油、酒花油、月桂叶油、留兰香油等，我国国标中允许使用的食用香料中。异戊酸除了用以配制干酪和奶油香精，微量用于水果型香精的配制。还可以用于制造医药、香料、调味品等。也可以用于烘烤食品、肉制品。目前异戊酸主要用于生产镇静催眠药溴异戊酰脲。但更多是用于生产香料。可以用作香料的异戊酸酯主要有异戊酸已酯、异戊酸丙酯、异戊酸异戊酯、异戊酸牻牛儿酯、异戊酸苄酯和异戊酸肉桂酯。低级异戊酸酯类可作为食用香料，高级异戊酸酯类可用于化妆品。

目前工业上生产异戊酸的方法是由异戊醇或异戊醛氧化得到异戊酸。其主要用的是应用强催化剂，以异戊醇或异戊醛为原料，通过氧化反应制得，此方法不仅需要催化剂，而且反应步骤繁琐，需时较长。异戊酸的生物合成鲜有报道，其可能是由于合成异戊酸的微生物未经发掘，或是因为微生物合成异戊酸的效率不高，这就制约了异戊酸的生物合成在工业上的应用。因此如何克服现有技术的不足，提高微生物在生产异戊酸上的应用是目前生物技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产异戊酸的方法，该菌株不仅不需要改造，而且易于分离和培养，除此之外，使用的发酵培养基不仅成本低廉，而且可以处理烟草工业产生的大量废弃物，在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种芽孢杆菌（Bacillus），已于2017年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 14609。

本发明的芽孢杆菌（Bacillus）的制备方法：

1）分离用培养基及培养条件：

稀释8~12倍的LB液体培养基：1000mL蒸馏水；胰化蛋白胨1g；酵母提取物0.5g；NaCl 1g；pH 自然，121℃灭菌20分钟；

2）菌株筛选：在上述液体培养基中添加20g/L的琼脂制备成固体培养基用于菌株筛选；

3）分离方法：

醇化中期的烟叶样品随机抽取2g，在无菌条件下剪碎，浸泡于150mL中无菌生理盐水中，在温度为37℃，转速为180转/分的条件下，振荡培养60分钟，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用5mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取100μL原始菌液分别稀释至10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，并分别吸取200μL涂布于稀释8~12倍的LB培养基，于37℃倒置培养24小时，培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得芽孢杆菌单菌落。