[发明专利]水稻稻瘟病广谱抗性基因Bsr‑d1的功能特异性分子标记

说明书

一、技术领域

本发明涉及水稻稻瘟病广谱抗性基因Bsr-d1的功能特异性分子标记，属于生物技术工程领域，专用于水稻稻瘟病广谱抗性基因Bsr-d1的基因型鉴定。

二、背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物，全国有一半以上的人口以稻米为主食。影响水稻生产安全的因素很多，其中病害问题是制约水稻生产的重要障碍之一。据统计，危害水稻的侵染性病害有300多种，有些分布于全世界，有些局限于部分地区。在我国，常年发生的水稻病害有29种(雷财林等，生物学通报，2004，39(11):4-7)。其中，由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae；无性态，Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病是水稻上最具毁灭性的病害之一，俗称水稻的“癌症”(Ou S H Rice Diseases,2nd edn UK:CAB International,1985，109-201)。稻瘟病在全球85个有水稻种植的国家和地区均有发生。据统计，在1975～1990年的16年间，由稻瘟病引起的全球水稻产量损失高达1.57亿t(Baker B，et al.，Science，1997，276：726-733)。我国每隔7～10年就发生一次较大规模的稻瘟病危害，受害面积达300～600万hm2，稻谷损失70～125万t(Shen M G，et al.Rice Blast Disease.UK：Int Rice ResInst，1994：321-331.)稻瘟病的防治途径主要是化学防治和种植抗病品种，长期实践证明，选育和推广抗病品种是防治稻瘟病最经济、有效和安全的方法。但由于稻瘟病菌具有高度的变异性，普通抗病品种种植3～5年后抗性就会逐渐丧失。因此，选择抗谱广、抗性持久的抗病基因作为抗源来选育新品种，已经成为抗病育种的最经济有效的策略之一。

传统的水稻稻瘟病抗病育种主要依赖于抗性表型的鉴定，不仅周期长且极易受环境条件和人为因素的影响，从而降低了目标基因的选择效率。另外，由于受可鉴别不同基因的鉴别菌系的限制，单纯地依赖表型鉴定很难实现多个抗性基因的聚合。分子标记辅助选择是利用与目标基因紧密连锁或共分离的分子标记来选择基因型，可以在水稻全生育期甚至种子鉴定目标基因及其纯合性，且不受环境影响，因而大大提高了选择的效率和准确性。开发与稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记，特别是根据抗性基因本身引起抗性变异的DNA序列差异开发出的基因功能标记进行分子标记进行辅助选择，不仅可以大大提高抗源筛选、抗性基因鉴定及育种选择效率，而且使得通过基因聚合手段培育持久、广谱抗病良种成为可能。

自20世纪60年代日本系统开展抗稻瘟病基因的遗传研究以来，国内外研究者已经从不同抗病品种中鉴定出80多个稻瘟病抗性基因，Pi-b、Pi-ta、Pi-d2、Pi9等30多个抗稻瘟病基因已经被克隆(杨勤忠等，中国农业科学，2009，42(5)：1601-1615)。Li(Cell,2017,170:114-126)等利用广谱高抗水稻地谷与基因组已经测序的66份非广谱抗病水稻进行GWAS(全基因组关联)分析，并应用高抗水稻地谷与高感材料丽江新团黑谷为亲本构建的重组自交系(抗病性经多年田间自然诱发和苗期接种鉴定)进行共相关分析，发现了编码C2H2类转录因子的基因Bsr-d1的启动子自然变异后对稻瘟病具有广谱持久的抗病性，进一步分析发现在地谷中，Bsr-d1基因的启动子区域因一个关键碱基变异，导致上游MYB转录因子对Bsr-d1的启动子结合增强，从而抑制Bsr-d1响应稻瘟病菌诱导的表达，并导致BSR-D1直接调控的H₂O₂降解酶基因表达下调，使H₂O₂降解减弱，细胞内H₂O₂富集，提高了水稻的免疫反应和抗病性。该等位变异在提高抗病性的同时，对产量性状和稻米品质没有明显影响，因而具有十分重要的应用价值。

因此，根据Bsr-d1基因的启动子区域关键变异碱基设计得到与目标基因共分离的PCR分子标记来快捷、准确鉴定Bsr-d1基因的不同基因型，将有利于广谱抗稻瘟病水稻新品种的选育，从而提高稻瘟病抗性育种的技术水平。

三、发明内容

技术问题：本发明针对水稻稻瘟病抗性改良选育过程抗性表型鉴定极易受环境和人为因素影响，从而降低目标基因选择料率的技术难题，根据稻瘟病广谱抗性基因Bsr-d1功能区域存在的单碱基差异，设计、合成与目的基因共分离的功能标记，并通过简单的检测方法，快速鉴定含广谱抗性基因Bsr-d1的水稻种质资源，同时还能进一步应用于分子标记辅助育种。

技术方案：