[发明专利]一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组及检测方法。

背景技术

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒Ⅱ型引起的猪呼吸道疾病综合征、皮炎肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭以及繁殖障碍等多种症状的传染病。德国学者Tischer在1974首次发现圆环病毒，此后很多国家陆续报道了猪圆环病毒病的发生。猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒引起的主要侵害机体生殖系统和神经系统的传染病。猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的呼吸道症状和母猪繁殖障碍的一种急性传染病。

猪圆环病毒病、猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸障碍综合征不仅引起猪只高死亡率，而且还会导致机体产生免疫抑制，引起其他病原的继发感染、药物疗效降低及造成疫苗免疫失败，对当前养猪业存在很大的威胁。这三种病均能引起发热、呼吸困难、腹泻、神经症状、免疫抑制及对种猪引起繁殖障碍等临床症状，病理变化和流行病学极为相似，临床上很难区分，因此建立PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR检测方法具有重要意义。

PCR是近年来动物疫病最常用的临床检测方法，具有灵敏度高、特异性好等优点，而多重PCR是在单一PCR的基础上加入多对引物，通过对反应条件和程序的不断优化，建立的一种可以在一个反应体系中同时扩增出多个核酸片段的检测方法，可以同时检测多种特定病原的单一或混合感染，具有省时省力，操作简单、快速，且具有很高的特异性和灵敏度，因此有很高的应用价值和前景。但多重PCR的一种关键问题是获得能再一次反应中进行扩增的引物组。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组及检测方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组，所述的引物组中包含有：

检测PCV2的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1；下游引物的序列为SEQ ID NO:2；

检测PRV的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:3；下游引物的序列为SEQ ID NO:4；

检测PRRSV的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:5；下游引物的序列为SEQ ID NO:6；

本发明的引物组用于制备检测PCV2、PRV、PRRSV的试剂盒；

本发明再一个方面提供一种用于非疾病诊断治疗目的的检测PCV2、PRV、PRRSV的方法，其PCR最佳反应条件：95℃5min；94℃30s，52.1℃35s，72℃30s，循环31次；最后4℃冷却10min。

本发明通过序列比对，针对基因的同源性序列设计引物，既能保证鉴定病原的正确性，又确保不漏检同种不同株病原，提高检测的特异性。另外，本发明的扩增片段长度适宜，三种PCR产物可根据长度明显区分。另外，通过PCR反应体系和反应条件的优化，得到特异性和灵敏性较高的针对特定基因的PCR检测方法。经最终实验证实，本发明的PCR检测方法由于引物设计和实验体系的选取，该方法对PCV2的最低检出浓度为4.53×10^-5ng/μL，对PRV的最低检出浓度为6.24×10^-5ng/μL，对PRRSV的最低检出浓度为6.37×10^-5ng/μL。且成本低廉，能够同步快速实现对PCV2、PRV和PRRSV的特异性和敏感性检测。

附图说明

图1为PCV2基因部分保守序列分析结果。

图2为PRV/猪猪孢疹病毒基因部分保守序列分析结果。

图3为PRRSV基因部分保守序列分析结果。

图4为PCV2扩增序列比对结果。

图5为PRV扩增序列比对结果。

图6为PRRSV扩增序列比对结果。

图7为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的最佳酶浓度，M代表DNA Marker DL1000，第1-7泳道分别代表Taq酶的添加量为0.3μL-0.9μL时的PCR扩增结果。

图8为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的最佳引物浓度，M代表DNA Marker DL1000，第1-7泳道分别代表引物的添加量为0.5μL-1.1μL时的PCR扩增结果。

图9为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的最佳退火温度，M代表DNA Marker DL1000，第1-7泳道分别代表退火温度为50.0℃-55.0℃时的PCR扩增结果。