[发明专利]一种基于核酸外切酶III辅助目标循环放大的无标记DNA质谱定量分析方法

权利要求书

1.一种基于核酸外切酶III辅助目标循环放大的无标记DNA质谱定量分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)根据目标DNA的碱基序列，设计能够与目标DNA碱基序列杂交形成双链的探针DNA，所述探针DNA的3′端为平末端，所述目标DNA的3′端为具有至少4个碱基以上的突出端；

(2)往目标DNA与探针DNA的杂交反应液中加入核酸外切酶III(Exo-III)，Exo-III能识别由目标DNA和探针DNA杂交所形成的双链DNA的3′平末端，并沿3′端到5′端的方向酶切水解探针DNA产生单个核苷酸和残余的DNA片段，同时释放出目标DNA，释放出来的目标DNA又与第二条探针DNA杂交从而引发下一个Exo-III水解探针DNA的循环反应；经过多次循环放大后通过加热使Exo-III失活从而停止反应，得反应混合物；

(3)将反应混合物通过透析纯化除去高浓度的盐离子以达到质谱检测的要求，然后使用质谱仪检测探针DNA的残余片段和未水解的探针DNA，并将探针DNA及其残余片段的多电荷离子的质谱响应构建成一条质谱数据矢量；

在合理的假设：目标DNA的浓度可以表示为探针DNA所有残余片段浓度的线性组合的情况下，推导出目标DNA浓度与探针DNA残余片段的多电荷离子质谱响应构建的质谱数据矢量之间服从以下模型：其中，x_k为第k个版本的质谱数据矢量；c_probe是长度为N个碱基探针DNA的浓度；c_(j+3),k是目标DNA浓度为c_targ,k时探针DNA被Exo-III水解后残余的(j+3)个碱基DNA片段的浓度；质谱图中出现的最小的DNA片段为4个碱基长度的DNA片段；s_j是探针DNA残余片段质谱响应的线性组合；乘子参数p_k用于描述由于质谱仪器不稳定引起的对第k个样品质谱信号强度的乘子效应；d_k是一个复合项，表示背景干扰和由质谱仪器不稳定对第k个样品引起的非乘子效应；

4)根据步骤(3)的结果，使用波谱形变定量分析理论在空白样本和标准样本的质谱数据基础上建立校正模型，并将校正模型用于复杂生物样本中目标DNA的定量分析及DNA单核苷酸多态性的特异性识别；所述空白样本是未添加探针DNA的待测实际样本，所述标准样本为目标DNA配制成的样本。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中Exo-III的酶切条件为37℃，2h，终止反应的条件为将反应混合物加热到80℃并持续10min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)是将反应混合物通过1KD的透析膜透析纯化除去高浓度的盐离子；然后将透析后的反应混合物进入6460三重四极杆质谱仪进行检测，获得反应混合物在500-1500m/z范围内的全扫描质谱数据；再利用LTQ OrbitrapVelos Pro轨道阱质谱仪确认质谱图中出现的离子的电荷数，通过离子的质荷比和相应的电荷数计算DNA片段的分子量，进而对DNA序列进行定性分析，并将带多电荷数的残余DNA序列和未水解的探针DNA序列的离子质谱响应构成一条质谱数据矢量。