[发明专利]内切葡聚糖酶NfEG12A突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及内切葡聚糖酶NfEG12A突变体及其编码基因和应用。所述突变体为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的内切葡聚糖酶NfEG12A的第7位和/或第111位的氨基酸Y突变为W。本发明的突变体的最适温度与最适pH均与野生酶一致，为65℃和pH 5.0，这些突变体对β‑1,3‑1,4‑葡聚糖和木葡聚糖的催化效率分别提高了0.5‑0.8倍，且具有良好的耐热性和pH耐受性，因此在工业中有非常可观的应用前景。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及内切葡聚糖酶NfEG12A突变体及其编码基因和应用。

背景技术

纤维素、半纤维素和木质素是植物细胞壁的主要成分。纤维素是由吡喃葡萄糖以不同比例的β-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的长链多糖聚合物。β-葡聚糖链通过分子内和分子间氢键的紧密排列形成不可溶的纤维素微丝。

NfEG12A是一种偏高温酸性酶，最适温度65℃，最适pH5.0，是目前已知的该家族中酶活最高的酶，为了进一步提高其工业应用潜能，对该酶进行分子工程改造，以提高其催化水解纤维类底物的效率。

发明内容

本发明的目的是提供内切葡聚糖酶突变体NfEG12A-Y7W、NfEG12A-Y111W、NfEG12A-Y7/111W。

本发明的再一目的是提供编码上述内切葡聚糖酶突变体的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述内切葡聚糖酶突变体基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述内切葡聚糖酶突变体基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述内切葡聚糖酶突变体基因的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述内切葡聚糖酶突变体的应用。

本发明对内切葡聚糖酶NfEG12A进行定点突变，分别构建了突变体NfEG12A-Y7W、NfEG12A-Y111W、NfEG12A-Y7/111W。

内切葡聚糖酶NfEG12A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：(加粗氨基酸序列为信号肽，下划线氨基酸为突变位点)

本发明在NfEG12A的7和111位点，通过定点突变构建了突变体NfEG12A-Y7W、NfEG12A-Y111W、NfEG12A-Y7/111W，所述突变体为内切葡聚糖酶NfEG12A的第7位的氨基酸Y、第111位的氨基酸Y分别或同时突变为W，从而使其对β-1,3-1,4-葡聚糖和木葡聚糖的催化效率分别提高了0.5-0.8和0.9-2.5倍，提升了其工业应用价值。

根据本发明的具体实施方式，设计各突变引物，以编码内切葡聚糖酶NfEG12A基因的野生型质粒pPIC9γ-Nfeg12A为模板进行定点突变。纯化得到含有突变体密码子的质粒，并将其转化进毕赤酵母感受态细胞GS115中进行表达，得到重组突变体蛋白。

本发明通过PCR的方式引入突变，获得突变体内切葡聚糖酶NfEG12A-Y7W、NfEG12A-Y111W、NfEG12A-Y7/111W。本发明还提供了包含上述内切葡聚糖酶基因的重组载体，命名为pPIC9γ-Nfeg12A-Y7W,pPIC9γ-Nfeg12A-Y111W,pPIC9γ-Nfeg12A-Y7/111W。

将本发明所述的内切葡聚糖酶突变体基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的内切葡聚糖酶基因插入到质粒pPIC9γ上的EorR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控。