[发明专利]一种青花菜游离小孢子培养获得再生植株的方法

说明书

本发明公开了一种青花菜游离小孢子培养获得再生植株的方法，属于生物技术领域。包括取适度的花蕾，进行4℃低温预处理24h，消毒后采用挤压法使游离孢子，过滤并离心，将纯化的小孢子悬浮在的液体培养基中，32.5℃高温热激处理24h后转移到25℃黑暗培养15‑20天；出现肉眼可见的胚状体后，置于光照下培养5～7d至出现子叶型胚状体,待胚状体转绿后接到继代培养基上萌发然后转移到生根培养基上生根，获得完整的再生植株；然后开瓶炼苗，驯化移栽到装有灭菌基质的营养钵中；利用该方法进行培养，获得较高的频率的胚状体，所获得的单倍体再生植株既是良好的育种材料，也是进行分子标记和遗传图谱绘制研究、基因克隆和转基因等研究的理想材料。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种青花菜游离小孢子培养获得再生植株的方法。

背景技术

青花菜是十字花科芸薹属二年生植物，在我国栽培面积广，适应性强，营养价值高，耐贮运，深受广大人民喜爱，是国内市场和出口创汇的主要蔬菜之一。目前生产上应用的杂交种主要是通过将国外引进的材料多代自交分离纯化，选育自交不亲和系培育出来的，一般需要分离6～8代。由于青花菜是绿体春化型作物,不易加代，使得育种周期长，并且连续自交多代后存在植株衰退现象，这些因素制约着我国青花菜优良品种选育工作的开展。

采用组织培养技术，开展青花菜游离小孢子培养和单倍体育种研究，能够为优良种质资源获得和新品种的培育创建一条新的有效途径。目前，国内的小孢子培养研究主要集中于青花菜型油菜和白菜等植物上，青花菜的小孢子培养研究相对滞后，主要问题是效率较低，进展缓慢，与应用于实际育种尚有一定距离。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分，说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述现有青花菜游离小孢子培养获得再生植株的方法中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明目的是提供一种青花菜游离小孢子培养获得再生植株的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种青花菜游离小孢子培养获得再生植株的方法，其特征在于：包括，

小孢子培养，将分离并清洗后的小孢子悬浮在pH6.2的液体培养基1中，调整小孢子密度为1×10⁵～2×10⁵个〃mL-1，并加入100μL 1％的活性炭混悬液，将所述加入活性炭混悬液的小孢子置于32.5℃恒温培养箱热激处理24h，再转移到25℃条件下静止黑暗培养15～20天；

胚状体的萌发，将所述经过培养的小孢子至出现肉眼可见的胚状体后，将所述胚状体培养，待所述胚状体发育到子叶期时转置于光照下培养5～7d，待胚转绿后转到继代培养基上培养，经过3-4次继代，将所得的无根试管苗转移到生根培养基中进行生根培养；

植株再生，待所述经过生根培养后得到的再生株长到含4～5片叶的健壮苗时，在培养室内开瓶炼苗，经驯化移栽到装有灭菌基质的营养钵中，经过25℃，12h光照和12h黑暗的培养条件，1周后将营养钵放置于外界阴凉处，逐步炼苗，3周后将其移栽到大田，获得植株。

作为本发明所述青花菜游离小孢子培养获得再生植株的方法的一种优选方案，其中，所述的胚状体的萌发，所述继代培养基配方为：B5、20g〃L-1蔗糖、12g〃L^-1琼脂、0.2mg〃L^-1 6-BA、0.1mg〃mL^-1活性炭，pH5.8；生根培养基配方为：B5、20g〃L^-1蔗糖、8g〃L^-1琼脂、0.2mg〃L^-1NAA，pH5.8。