[发明专利]槐角胰蛋白酶抑制剂的制备、活性测定及抑制常数测定的方法

权利要求书

1.槐角胰蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于：取去皮磨碎的槐角粉25g，加入5倍量的丙酮于9.6℃下抽脂8小时，在通风橱中用布氏漏斗抽成干粉，加入5倍量20mmol/LTris -100mmol/LNaCl pH8.0缓冲液抽提蛋白8小时，然后11000r/min离心20min，取上清，然后再70℃水浴加热10min，再11000r/min离心20min，取上清，用定性滤纸过滤除去杂质，用3kDMWCO(MILLPORE)浓缩至8mL，用亲和层析的方法得到纯化的胰蛋白酶抑制剂。

2.槐角胰蛋白酶抑制剂活性的测定方法，包括槐角胰蛋白酶抑制剂,其特征在于：按照以下步骤进行，

a.STI的分子量测定:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,以UnstainedProteinMolecular Weight Marker为对照，分离胶浓度15%,恒流15mA,电泳3h，测定其分子量；

b.热稳定性测定：将粗酶液分别置于50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中各保温10min，离心，取上清，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其稳定性；

c.活性测定：将STI溶于20mmol/LTris-100mmol/LNaCl pH8.0缓冲液中,分别在25℃、35℃、45℃和55℃处理10min,迅速冷却,终止反应后，然后以BAPNA为底物，取浓度为33ug/mL的STI30uL,加入浓度为2mg/mL的胰蛋白酶60mL,最后体积用20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液补充至3mL，在37℃保温10min，加浓度为0.15mol/mL的BAPNA溶液40uL，37℃反应10min，立即加入0.5mL33%醋酸溶液终止反应，以不加抑制剂的试样为对照，在410nm处测其吸收值，测定其抑制胰蛋白酶的活性；

酶活性单位定义为：在实验条件下，每分钟内水解0.01umol/LBAPNA释放对硝基苯胺的量；

抑制剂活性单位定义为：在相同条件下，降解1个酶活单位所需的抑制剂量；

d.酸碱稳定性测定:将TBTI加入以下体系:pH5.0,pH6.0,pH7.0,pH8.0,pH9.0,pH10.0的20mmol/LTris-100mmol/LNaCl pH8.0缓冲液, 然后以BAPNA为底物，取浓度为33ug/mL的STI30uL,加入浓度为2mg/mL的胰蛋白酶60mL,最后体积用20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液补充至3mL，在37℃保温10min，加浓度为0.15mol/mL的BAPNA溶液40uL，37℃反应10min，立即加入0.5mL33%醋酸溶液终止反应，以不加抑制剂的试样为对照，在410nm处测其吸收值，测定其抑制胰蛋白酶的活性；

酶活性单位定义为：在实验条件下，每分钟内水解0.01umol/LBAPNA释放对硝基苯胺的量；

抑制剂活性单位定义为：在相同条件下，降解1个酶活单位所需的抑制剂量；

e.蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝法进行测定。

3.槐角胰蛋白酶抑制剂抑制常数Ki的测定方法，其特征在于：以BAPNA为底物，取浓度为0.2mg/mL的胰蛋白酶65uL，加入浓度为0.059mol/L的STI 70uL，最后体积用20mmol/LTris-100mmol/LNaCl pH8.0缓冲液补充至3mL，在37℃保温10min，分别加入25、30、35、40、45、50uL的浓度为0.15mol/L的BAPNA，在37℃保温10min，立即加入0.5mL 33%醋酸溶液终止反应，对照管以测活缓冲液代替酶液，在400nm处测其吸收值，以1/[S]对1/V作图，与底物影响之双倒数图对照比较，推出其抑制类型，计算出Ki。