[发明专利]三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置及方法

说明书

本发明涉及一种三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置及方法，采用飞秒锁模激光器作为光源，以物镜在样本处形成聚焦的高斯光束，通过扫描振镜的扫描，形成虚拟光片照明层，在垂直于光片照明层方向进行成像。利用飞秒激光器的非线性倍频效应，实现样本的双光子荧光光片成像。另外，通过二向色分束镜将探测光路分为不同波长的两束，荧光被透过进行双光子光片荧光成像，近红外光被反射，并由光栅分光线型光束并由面阵CCD探测解析可同时获得被测样本的三维光谱图像。通过线性位移台带动被测样本与光片照明层产生相对运动，从而获得样本的三维光谱图像。通过多种成像模式有机结合，可以为生物医学、环境监测等领域提供更丰富的光学和光谱学信息。

技术领域

本发明涉及一种光学显微及光谱成像装置，特别涉及一种三维双光子光片显微及光谱多模式成像方法及装置。

背景技术

光片显微成像是近二十年来得到飞速发展和广泛应用的光学成像方法。光片显微成像（light-sheet microscopy）的本质是于目标三维样本之中形成一个微米级厚度的光片，该光片照明到的目标样本发出的光信号在照明方向的正交方向上被面阵光电探测器收集，形成目标样本一整个切面的图像。光片显微成像的优势在于同时获得二维图像，经过扫描后可以快速获得三维图像，在各种高分辨的三维成像方法中是最为便捷和快速的成像方法，另外不对当前光片以外的样本产生照明，避免了多余的光漂白和光毒性的发生。光片的产生最早是基于圆柱透镜，产生的光片厚度不均匀性较大。2008年，Keller P. 和StelzerE.等人提出了基于扫描振镜的光片产生方式，称为数字扫描型光片显微成像方法(digitalscanned laser light sheet microscopy)。这种光片产生方式本质是用高斯光束扫描形成的虚拟光片，带来的优势为可以将各种光束调制方法添加在光束中，例如，对光束进行贝塞尔调制、艾里光束调制、结构光照明、双/多光子照明等，以实现更高分辨率、更均匀的视场等不同要求。双光子光片显微系统相较传统光片显微系统，分辨率更高，穿透深度更大，并且由于照明光束的频率一般在近红外波段，光毒性和光漂白降到更低。

光谱检测不同于光学显微或荧光显微成像，不通过直接的图像观察来确定物质结构的存在与否和形态特征，而是通过物质返回的光谱信息，来判断物质结构中官能团的构成情况。近红外光谱是常用的吸收光谱检测波段，可以反映物质中的绝大多数有机化合物的组成和结构信息，并且可测量形式灵活，因此近红外光谱检测与分析广泛应用于生物医学、医药临床、环境监测、农业、食品、石油化工等领域。近红外光谱成像在近红外光谱检测的基础上增加检测点的数量，以形成大视场内的二维或三维光谱图像，提供有空间分辨的区域性的物质光谱信息。

光学显微成像和光谱成像同为光学方法，适合的领域有较多相似之处，但又提供两类完全不同的信息。如果能够将光学显微成像和光谱成像以合适的方法结合起来，将形成一个多功能显微成像检测仪，成为生物医学、环境监测、食品、农业等领域的有力研究工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置及方法，该装置及方法能够实现光片显微成像、双光子光片显微成像、光谱成像、双光子光片显微及光谱融合多模式成像，可广泛适用于生物医学、环境监测、食品、农业等领域的研究。

本发明的技术方案如下：一种三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置，包含宽光谱飞秒锁模激光器、飞秒激光光片照明层发生单元、光片显微三维成像单元、光谱三维成像单元、合束分束单元、三维位移单元，

所述飞秒激光光片照明层发生单元：包括单模光纤、光纤准直器、准直透镜、扫描振镜、f-θ透镜、镜筒透镜和聚焦透镜；宽光谱飞秒锁模激光器产生的宽光谱飞秒激光源依次经过光纤滤波、光纤准直器后得到基横模准直光源，并通过扫描振镜、f-θ透镜、镜桶透镜和聚焦透镜，在被测生物样本上形成一个线型光源；其中，扫描振镜和f-θ透镜，可将被线光源随着被测样本表面进行快速扫描，从而线型光源可进一步变成一个虚拟光片照明层；