[发明专利]一种高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法

说明书

本发明公开了一种高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法。本发明提供了一种高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法，包括如下步骤：向贴壁培养的汇合率为85％‑90％的鸡胚胎原代成纤维细胞中加入终浓度100ng/ml的诺考达唑，进行阻抑培养4h，然后轻拍培养皿使M期细胞脱落后离心收集G2/M期细胞。本发明实验证明，本发明利用诺考达唑(100ng/ml)阻断法和机械震荡法相结合，可使鸡胚胎原代成纤维细胞同步化至G2/M期的比例高达95.62％。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法，尤其涉及一种适用于染色体分选的高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法。

背景技术

连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为一个细胞周期(cell cyc1e)。整个细胞周期可分为间期和有丝分裂期，M期即为有丝分裂期，是染色体真正开始分离时期。间期又可进一步细分为G1期、S期、G2期3个时相。在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中只有少数细胞在进行有丝分裂活动(M期)，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。为了获取特定阶段的生化材料，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质。

获得M期细胞方法从理化角度可分为化学阻断法和物理选择法两类。

化学阻断法是利用某些特定的化学试剂破坏微管的形成，将细胞阻断在M期。常用的阻断药物有秋水仙素，秋水仙胺、诺考达唑等。化学阻断方法的缺点是这些阻断试剂都会有一定毒性，如果作用浓度或作用时间不合适，会造成细胞产生异常分裂，生长畸形甚至死亡。不同物种的不同类型细胞，对这些化学阻断试剂的耐受性是不一样的，因此对不同物种不同类型的细胞获得G2/M期细胞的最佳阻抑浓度及最佳阻抑时间通常需要进行大量的试验摸索。

G2/M期细胞物理选择法是利用处于M期细胞会变圆隆起，与培养皿的附着性低的特性，经轻轻振荡，M期细胞易脱离器壁，悬浮于培养液中，可收集培养液而获得所需的M期细胞。物理选择法的缺点是贴壁培养细胞处于分裂期的细胞数量极少，不能实现短期大量收集M期细胞，且若振荡幅度过大可能收集到间期细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：向贴壁培养的鸡胚胎原代成纤维细胞中加入终浓度100ng/ml的诺考达唑，进行阻抑培养4h后，轻拍培养皿，收集脱落的细胞得到G2/M期细胞。

上述方法中，所述加入终浓度100ng/ml的诺考达唑的时机为待贴壁培养的鸡胚胎原代成纤维细胞汇合率85﹪－90﹪时。

上述方法中，所述阻抑培养的时间为4h小时。

上述方法中，所述鸡胚胎原代成纤维细胞培养所用的培养基由体积百分含量20％的FBS和体积百分含量80﹪的DMEM/F12培养基组成。

上述方法中，在所述阻抑培养4h后，震荡收集鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期细胞；

所述震荡收集为先拍打培养皿使G2/M期细胞脱落，再离心收集。

上述方法中，所述鸡胚胎原代成纤维细胞为第1-10代中任一代细胞。

由上述方法制备的G2/M期细胞也是本发明保护的范围。