[发明专利]一种检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法

权利要求书

1.一种检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)PPV病毒DNA的提取；

(2)CSFV、PRRSV、JEV病毒RNA的提取以及反转录；

(3)特异性引物设计与筛选；

(4)对步骤(3)所设计的特异性引物进行PCR反应条件优化；

(5)按照步骤(4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR扩增特异性验证；

(6)按照步骤(4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR敏感性验证；

(7)按照步骤(4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR稳定性验证；

(8)按照建立的多重PCR方法对临床样品的检测。

2.根据权利要求1所述的检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的PPV病毒DNA的提取方法为：取适量PPV病毒液，置于1.5mL Eppendorf管中，参照OMEGA公司的E.Z.N.A^TMTissue DNA Kit提取试剂盒说明书进行，将提取的基因组DNA置于-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，其特征在于，步骤(2)中，CSFV、PRRSV、JEV病毒RNA的提取及反转录方法为：取CSFV、PRRSV和JEV病毒液，参照TaKaRa公司MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit说明书提取病毒RNA，将提取的病毒RNA反转录成cDNA；按照Magen公司M-MLV H-First-Stand Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行，将反转录的cDNA置于-20℃保存备用。

4.根据权利要求1所述的检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述特异性引物的设计与筛选具体为：应用生物学软件对CSFV基因、PPV基因、PRRSV基因和JEV基因进行同源性分析，筛选确定引物，确保所设计引物必须为特异性引物，一对引物只能扩增出相应病毒的序列片段，并且与其它引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构；所述设计的引物序列为：

CSFV的特异性引物：

F:5′-TGCAACTGAATGACGGGAC-3′

R:5′-GCCAAATACCTCCTACTGACCAC-3′

PPV的特异性引物：

F:5′-AAAAACAATCCACCAGGACAAC-3′

R:5′-CTGGATCTCATTTTTGCTGTGA-3′

PRRSV的特异性引物：

F:5′-CGGGCGGTATGTCCTAAGTA-3′

R:5′-ACCTCAACTTTGCCCCTTTT-3′

JEV的特异性引物：

F:5′-AGCTTGTTGGACGGCAGAG-3′

R:5′-GCCACATGATTGAGCCTTCA-3′。

5.根据权利要求1所述的检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择25μL的PCR反应体系，体系包含10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)2.5μL，2.5mmol/L dNTP 3μL，5U/μL Taq聚合酶0.4μL，DNA与cDNA混合模板1μL，引物工作浓度为10μmol/L，根据多重PCR条带的明亮，适当调整3对引物加入量的比例；退火温度根据引物Tm值范围进行50℃、51.7℃、52.9℃、54.3℃、55.4℃、56.6℃、57.8℃、59.9℃退火温度梯度试验，最后确定最佳的多重PCR条件。

6.根据权利要求1或5所述的检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，其特征在于，步骤(4)中，最佳多重PCR条件具体为：25μL反应体系中10×buffer(Mg²⁺)2.5μL，dNTP 3μL(2.5mmol)，4对引物上下游混合引物2.4μL，Taq聚合酶0.4μL(5U/μL)，DNA/cDNA混合模板1μL，加灭菌双蒸水至25μL；最佳的多重PCR反应条件为：94℃5min；94℃1min，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。