[发明专利]一种抑制人TNFAIP1基因表达的siRNA在肝癌细胞增殖研究中的应用

说明书

本发明公开了一种抑制人TNFAIP1基因表达的siRNA及其慢病毒载体构建并在肝癌细胞增殖研究中的应用。本发明以RNA干扰技术为基础，从GenBank获得人TNFAIP1基因的cDNA序列，设计并合成了靶向人TNFAIP1基因的一对siRNA，并成功构建了它们在哺乳动物细胞内的慢病毒表达载体。本发明所述的siRNA能高效特异性地抑制TNFAIP1基因的mRNA和蛋白水平的表达，不对其它BTB蛋白产生沉默作用。建立的肝癌TNFAIP1低表达细胞株，为深入研究肝癌及其它相关肿瘤中TNFAIP1的作用分子机制奠定基础。本发明还研究TNFAIP1与肝癌发生发展以及分裂增殖、迁移、侵袭和凋亡的关系，为揭示肝癌的发病机制以及肝癌的治疗提供了重要线索。

技术领域：

本发明涉及医学分子生物学领域。具体地说，本发明涉及一种抑制人TNFAIP1基因表达的siRNA及其慢病毒载体构建并在肝癌细胞增殖研究中的应用。

背景技术：

近几十年来，恶性肿瘤的发病率逐年增高并严重影响着人类的身体健康，成为全球第三大死因。肝细胞肝癌(HCC)作为肝癌的一种主要类型是世界上第五个最常见的癌症，80%的病例发生在发展中国家。在我国的肝癌患者中，HCC约占80%-90%（华夏医药，2009，4(3):170-173）。自20世纪90年以来，HCC在癌症死亡率中排名第二，并且男性肝癌患者在许多国家中也越来越频繁。根据世界卫生组织的统计数据表明，全世界每年约有50万人死于肝癌，并且每年新发病的患者高达60万例。全世界各地HCC的发病率不尽相同，其中以非洲地区及东南亚国家最高包括中国、韩国和日本等，同时这些地区也是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高发区。虽然我国的医护工作者一直致力于肝癌的研究，但由于其高复发率和转移率，对于肝癌患者来说手术切除后长期的预后工作仍然是一个很大的挑战。因此深入研究肝癌的发生机制并寻找治疗肝癌的新型生物靶标具有极大的临床应用价值。

小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）有时称为短干扰RNA（shortinterfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与RNA干扰（RNAi）现象，通过人为的引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA，诱导内源靶基因mRNA 降解，从而达到减少基因表达的目的。siRNA可经多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的敲弱（knockdown）效果。siRNA具有高度的特异性，干扰效率高而且操作简单，因此可利用经过适当剪裁的siRNA之互补性，来对已知序列的基因进行标定，这种现象使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。

TNFAIP1，另名B12，其蛋白由316个氨基酸构成，分子量为36kDa，和KCTD10、PDIP1(KCTD13)同属PDIP1家族，又是KCTD蛋白家族的一员（Journal of Biological Chemistry,1992, 267:1317-1326）。正常细胞的TNFAIP1表达相对较高，而在癌细胞中TNFAIP1的表达较低，TNFAIP1能够调节细胞的增殖速率（Yi chuan, 2006, 28:918-922）。Hela细胞中，TNFAIP1的表达增强，会和紫杉醇竞争性地与β-tubulin结合，增加细胞对紫杉醇的抗性（Oncogene, 2014, 33:3246-3255）。使用告达庭（caudatin）处理Hela和HEC-1A细胞，则发现促进了细胞的形态变化、抑制了细胞增殖、克隆形成、迁移和细胞集落形成，是通过促进TNFAIP1的表达实现其抑癌作用的（International Journal of Oncology, 2016, 49:1638-1650）。因此，TNFAIP1在DNA合成、DNA的修复、细胞凋亡和人类的多种疾病中起着相当重要的作用。