[发明专利]用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物

说明书

本发明公开了一种用于快速繁殖过表达ANG‑1的EPC的组合物，通过对人体外周血或骨髓中获取的单核细胞进行培养获得干细胞培养基制剂X，将该制剂添加到含有多种细胞培养因子的内皮细胞基础培养基中得到本发明的组合物。通过实验发现，干细胞培养基制剂X能够明缩短过表达ANG‑1的EPC的传代培养周期，并能有效提高表达ANG‑1的EPC的单代增殖倍数。将用本发明的组合物大量培养的过表达ANG‑1的EPC用于构建组织工程骨，有望解决骨组织工程研究中的血管化问题。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体地，涉及用于快速繁殖EPC的组合物，更具体地，涉及用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物。

背景技术

由于创伤、感染、肿瘤等原因造成的各种类型骨缺损是我们临床上遇到的常见问题，骨组织工程技术的逐渐兴起为骨缺损的修复提供了有效的解决策略，但在应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，核心部位往往因为没有有效生成血管造成坏死，因此急需解决组织工程骨血管化问题。

血管内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)是一群具有游走特性，尚未表达成熟血管内皮细胞表型，能分化为血管内皮细胞直接参与血管形成。它在骨髓、脐带血及外周血中均存在,在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用，并以血管发生方式形成新生血管。

血管生成素-1(Angiopoietin-1，ANG-1)能够调控存在的血管丛以出芽的方式萌生出新生血管，实现血管生成。具体地，ANG-1特异性作用于内皮细胞Tie2受体，召集血管周细胞和平滑肌细胞，通过内皮周围支持细胞的聚集，包装内皮管道，形成完整的血管壁。但是，ANG-1蛋白在体内很快被血液、组织液稀释，半衰期短，很难在局部保持持续的有效作用浓度，而且局部大量应用副作用严重。

随着基因工程技术的发展，转基因的组织工程技术为血管化提供了新的思路和方法。用外源基因ANG-1转染EPC制备过表达ANG-1的EPC，既能使ANG-1基因在EPC内持续、高效的表达，又能优化EPC促血管新生的效果，将这种转染细胞种用于构建血管化组织工程骨，有望解决骨组织工程研究中血管化问题。

EPC数量有限，获取困难，将过表达ANG-1的EPC用于构建血管化组织工程骨，需要对过表达ANG-1的EPC进行体外快速繁殖培养。EPC体外培养时，培养周期长，单代繁殖数量少，且需要经纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)介导贴壁生长才能更好地存活。中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院分离了人外周血、脐带血、骨髓以及脐带来源的内皮祖细胞对其进行了贴壁培养，研究了不同来源的内皮祖细胞的增殖活力、细胞周期和免疫表型。哈尔滨医科大学附属第二医院血管外科研究了不同种类培养基和不同培养血清浓度对EPC培养增殖的影响，但是，通过调整培养基的种类和培养用血清浓度并没有明显提高EPC的单代增殖数量。中国专利公布CN101940590A公布了一种促进创伤愈合的制剂，通过诱导单核细胞获得EPC，进而对EPC进行体外培养，最后分离EPC获得无细胞培养基，用该无细胞培养基制备了促进创伤愈合的制剂，但是，并没有证明该制剂能够促进血管形成，而且制剂在体内应用容易被血液、组织液等稀释，不利于长期发挥功效。

然而，目前并没有专门适用于过表达ANG-1的EPC的培养组合物，在常规的EPC培养基中，由于基因组上各个基因的平衡性以及外源基因对原始基因在表达资源上的竞争，导致培养基中的资源大部分用于ANG-1的表达，而细胞繁殖明显受到抑制，尽管进行过表达，但单个细胞的表达量是非常有限的，一旦细胞繁殖受到抑制，细胞数量低，则ANG-1的总表达量非常有限。因此想要大量生产表达ANG-1，则需要提高细胞数量，实现过表达ANG-1的EPC的快速大量繁殖。

综上所述，需要提供一种用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，缩短EPC体外培养的培养周期，增加EPC体外培养单代繁殖数量。

发明内容