[发明专利]一种筛选三七根际生防菌微生物的方法

说明书

本发明涉及一种筛选多功能有益微生物的方法，属植物保护领域。该方法针对目前利用体外抑菌圈法筛选出的有益微生物在三七根际不能很好地发挥防治作用的缺点，提供从三七土壤中筛选既能利用三七根系分泌的皂苷作为营养进行生长又能有效拮抗根腐病菌的微生物的方法。它首先利用三七根系进行代谢物粗皂苷提取，再利用提取的粗皂苷制作选择性培养基，然后利用选择性培养基筛选以皂苷作为营养进行生长的微生物，最后利用对峙培养法筛选对根腐病菌具有拮抗能力的微生物。采用本发明方法筛选出来的微生物菌株，既可以在三七根际很好地定殖，又能有效拮抗根腐病菌，最终实现三七种植根腐病的生态防控。

技术领域

本发明涉及植物保护领域中筛选多功能有益微生物的方法，具体涉及一种筛选既能在三七根际定殖又能拮抗三七根腐病菌的微生物的方法。

背景技术

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)属五加科人参属植物，是我国特有的名贵中药材，具有散瘀止血，消肿定痛的功能，对治疗心脑血管疾病具有显著疗效。云南是三七的主产地和原产地。然而，三七生长存在严重的连作障碍问题，且由于连年大面积单一种植，连作障碍已严重影响三七的产量和品质。目前生产中主要通过化学农药和轮作倒茬来缓解连作障碍，但农药的大量使用不但未明显地减轻连作障碍，反而导致严重的农药残留和重金属超标等药品安全问题。轮作能较好的克服连作障碍，但三七轮作期限一般需要20年以上。随着市场对三七需求量的不断增加和新垦地的减少，三七种植逐渐从道地产区向非道地产区转移，严重影响三七药材的道地性和原产地保护。因此，如何克服三七连作障碍，确保药品安全和缩短土地再植周期是实现三七产业可持续发展的关键。

前期研究表明，三七连作障碍主要表现为根腐病发生严重。由于引起根腐病的主要是一些典型的土著型病原菌，化学杀菌剂和抗病品种的方法很难有效防治。利用有益微生物对根腐病菌对拮抗作用进行防治是最具潜力的防治方法。但众多研究表明，使用对病原菌具有抑制活性的生防菌效果不理想，主要是有益微生物难以在三七根际定殖，发挥拮抗功效。目前筛选生防菌的方法很多，主要采用的方法是体外抑菌圈法(方中达.植物病学研究方法.中国农业出版社，1998)，具体步骤主要方式有：(1)将采集的土样(过80目筛)10g加入装有90mL无菌水的三角瓶中(内装玻璃珠若干),28℃摇床振荡20min,然后进行10倍梯度系列稀释。吸取稀释液0.1mL放入NA平板上均匀涂布,于28℃下培养24h～72h,挑取不同类型的菌落采用平板对峙测定法，观察有无抑菌圈的形成。然后，选出拮抗性较好的菌株,进一步作拮抗试验。(2)将根际土按10倍稀释法稀释后，吸取稀释液0.1mL放入PDA平板上均匀涂布，于常温下培养3～4天，挑取不同类型的菌落纯化，制成发酵液，在无菌操作台上混入适温的培养基中，倒平板，待培养基冷却后，将直径为6mm的菌饼接种于平板中央，于25℃下培养3～4天，采用十字交叉法测量菌落直径，筛选出有抑制的拮抗菌。利用这些方法筛选获得了很多在室内对根腐病菌具有很强拮抗能力的有益微生物，但是这些生防菌在大田中不能成功定殖，随着时间的推移，很快在三七根际土壤中消失,不能很好发挥拮抗作用。

发明内容

本发明的目的是针对目前利用体外抑菌圈法筛选出的有益微生物在三七根际不能很好地发挥防治作用的缺点，提供了一种从三七土壤中筛选既能利用三七根系分泌的皂苷作为营养进行生长又能有效拮抗根腐病菌的微生物的方法。具体是利用三七代谢物皂苷为原料制作培养基筛选能利用皂苷作为碳源生长的微生物。

本发明的技术方案是：

一种筛选三七根际生防菌微生物的方法，具体包括如下步骤：

(1)利用三七根系进行代谢物粗皂苷提取：选择健康的三七块根，洗净切成薄片，风干，磨成三七粉并过80～100目筛网，称取三七粉100g，用甲醇超声提取，提取后离心分离，收集上清液，将上清液蒸发浓缩除去甲醇，然后冷冻干燥成粗皂苷粉末，-25℃～-15℃条件下保存备用。

本发明优选2～3年生的三七作为原料；所述的三七块根优选为切成1～2cm的薄片。