[发明专利]视网膜色素上皮细胞体外培养方法及其专用培养基

说明书

本发明公开一种视网膜色素上皮细胞体外培养方法及其专用培养基，即将视网膜色素上皮细胞接种至基础培养基中，每天向基础培养基内加入维生素C和丙戊酸，培养温度37℃±1℃，CO2浓度为5%；本发明提供的培养基和方法可实现高效扩增，所获得的视网膜色素上皮细胞可传代至P8代，干性标记物CD133呈阳性的细胞(即CD133＋视网膜色素上皮细胞)的比例高达99％，而目前不添加添加物的培养基可传代至P4代，有效解决了移植手术供体缺乏的问题，降低了伦理争议。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，特别是一种具备干细胞特性的新型视网膜色素上皮细胞体外培养培养方法及其专用培养基与培养产物。

背景技术

视网膜退行性病变是引起不可逆致盲眼病的主要病因，其中主要包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病。目前全球年龄相关性黄斑变性患者大约有3千万到5千万，而视网膜色素变性患者约1百万。我国的年龄相关性黄斑变性患者大约超过2000万人，并预计将在2050年增加一倍。

视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium,RPE)细胞在视网膜十层结构中扮演着极其重要和多重的角色，包括营养和支持光感受器细胞，参与血视网膜屏障的建立等等。RPE细胞的退化是许多不可逆致盲眼病的主要诱因和主要病理变化，其中主要包括年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration,AMD)、视网膜色素上皮细胞变性(Retinitis Pigmentosa,RP)、Startgardt’s症等视网膜退行性病变。

由于视网膜退行性病变主要表现为黄斑区视网膜色素上皮(RetinalPigmentEpithelium,RPE)的损伤，因此再生医学RPE细胞的替代移植治疗成为治疗研究的主要方向。迄今已报道了多种来源的RPE细胞移植，其中人RPE细胞具有免疫原性小，不引起T细胞显著的特异性免疫反应，还可以抑制T细胞激活，避免了免疫抑制剂的使用；具有较强的体外增殖能力；人RPE细胞在体内可以分泌营养因子，与宿主视网膜形成突触连接；在致肿瘤性风险上明显优于干细胞来源的RPE细胞；能够表达多种RPE特有的功能性标志物等优点，是视网膜色素上皮细胞移植替代治疗最有希望的细胞来源之一。

以往视网膜色素上皮细胞的在体外分离和培养后干细胞特性明显下降，只能传代至P3-P4代。一方面，缺乏干细胞特性的人视网膜色素上皮细胞在体外难以大量扩增，既难以供应临床应用，又增加了取材限制、经济负担和伦理争论。另一方面，缺乏干细胞特性的人视网膜色素上皮细胞在移植后存活能力和治疗效果受限。因此，如果想让人视网膜色素上皮细胞进行大规模生产以广泛应用于临床，并提高细胞移植治疗的效果，必须在无血清培养体系下提高人视网膜色素上皮细胞的干细胞特性。

申请人前期公开了一种“视网膜色素上皮细胞的培养基”(中国专利201610258139.5)，后期研究发现该培养基培养下，人视网膜色素上皮细胞干细胞特性和增殖能力有限，只能够培养至P4代，P4代后出现明显老化不能生长至融合，并且在该培养基体外培养下P1-P3代细胞只能定向分化成为成熟的人视网膜色素上皮细胞(参见文献：胎儿视网膜色素上皮细胞的原代培养和体外增殖能力的测定，袁松涛，中华细胞与干细胞杂志，2014年2月第4卷第1期)。

因此，本领域迫切需要研发一种体外维持人视网膜色素上皮细胞体外干细胞特性的培养体系。

发明内容

针对上述问题，发明人经过广泛而深入的研究，经过大量筛选和测试，首次意外发现，将维生素C和丙戊酸添加到无血清基础培养基中，所制备的培养基可以非常有效地维持视网膜色素上皮细胞的干性。试验结果表明，用本发明的添加有维生素C和丙戊酸的培养基培养扩增的人的视网膜色素上皮细胞，增值能力增强，不仅能够在体外多传代到P8代，培养出具有多向分化的潜能的干性克隆团块，而且干性蛋白标记物CD133呈阳性的细胞(即CD133⁺视网膜色素上皮细胞)的比例高达99％，进而在此基础上完成了本发明。