[发明专利]一种检测肿瘤单细胞基因组单倍体拷贝数变异的方法

权利要求书

1.一种检测肿瘤单细胞基因组单倍体拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

1)取同一病例的至少三个肿瘤单细胞样本，并以其正常组织大量细胞为对照样本，同时进行全基因组低深度测序和全外显子或全基因组高深度测序，其中单细胞样本需要进行单细胞扩增后再测序，其中，对于全基因组低深度测序，每个样本测序量平均为500M-1G原始数据；对于全外显子或全基因组高深度测序，每个样本测序量平均为8-10G原始数据；

2)将测序获得的基因组序列与参考基因组比对，根据染色体坐标顺序对比对结果进行排序，并去除PCR形成的重复序列，其中对于全外显子高深度测序数据还需要使用突变检测软件GATK软件包对比对结果进一步进行indel重比对和碱基质量矫正；

3)利用步骤2)处理后的全基因组低深度测序数据进行全基因组拷贝数状态分析；

4)对步骤2)处理后的全外显子或全基因组高深度测序数据通过群体多态性位点检测方法进行突变检测；在检测结果中，对正常组织大量细胞样本中的突变进行过滤，筛选出覆盖深度大于X且突变等位基因频率大于P1而小于P2的突变位点，构建可信的遗传的杂合多态性位点集合，其中X为大于0的某一数值，0P10.5P21；然后初始化等位基因类型矩阵，即设定该集合的每个位点初始无分类，定义为“0”；

5)根据步骤4)获得的位点集合，计算每个肿瘤单细胞样本相应位点的覆盖深度以及突变等位基因频率，通过设定覆盖深度下限标准为4，过滤掉覆盖深度低于4的位点，得出该肿瘤单细胞中遗传的杂合多态性位点的突变频率信息；

6)从某个肿瘤单细胞样本开始，以特定大小窗口沿其基因组各染色体滑动，窗口中心每滑动到有突变频率信息的遗传的杂合多态性位点，首先判断该位点突变频率是否大于T1或者小于T2，其中0T20.5T11，“否”则滑动到下一个位点，“是”则计算窗口内突变频率大于T1或小于T2的位点的数量总和；判断该数量总和占窗口内位点总数量的比例是否大于P，其中0P1，P的数值需要根据不同单细胞扩增方法等位基因丢失比率进行调整，“是”则推断窗口内两亲本等位基因频率有偏移，并判断该位点是否满足下述三个条件之一：i)该位点未被定义；ii)该位点被定义为1且突变频率大于T1；iii)该位点被定义为-1且突变频率低于T2；如果满足上述三个条件之一，则将窗口内突变频率大于T1的位点均设定为1，突变频率小于T2的位点设定为-1；如果上述三个条件均不满足，则在等位基因类型矩阵中将窗口内突变频率大于T1的位点设定为-1，而小于T2的位点设定为1；

7)依次对不同的肿瘤单细胞样本重复步骤6)的过程，直至遍历完成所有肿瘤单细胞；

8)以步骤3)所得单细胞基因组拷贝数分析窗口为基本单位，以单细胞基因组拷贝数分析窗口大小的N倍为单倍体拆分窗口大小，沿着染色体坐标位置以单倍体拆分窗口大小为步长移动，其中N为大于等于1的整数；每个窗口内分别统计标记为1、0和-1的位点突变频率中值r_p、r_z和r_n；如果为0的位点数量占窗口内位点数量50％以上则设定该窗口内1，-1的位点突变频率均为0.5，否则根据窗口内r_p和r_n计算两种单倍体的频率r₁＝r_p/(r_p+r_n)，r_-1＝r_n/(r_p+r_n)；将r₁和r_-1再分别乘以该窗口内单细胞基因组拷贝数数值即得到每个单倍体拷贝数结果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中比对前需要对测序下机的数据进行质量控制，单细胞样本的数据需要去除扩增引物序列及结合序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中对于单细胞样本的全基因组数据，使用针对单细胞的全基因组拷贝数分析方法分析其全基因组拷贝数状态。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述X的取值为4，所述P1＝0.3，P2＝0.7。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中突变频率的阈值T1设为0.8，T2设为0.2；特定百分比P为70％。