[发明专利]生物反应器扩增流感病毒H1N1的优化工艺方法在审

专利信息
申请号: 201810027791.5 申请日: 2018-01-11
公开(公告)号: CN108060140A 公开(公告)日: 2018-05-22
发明(设计)人: 李兰娟;陈科达;余东山;吴晓鑫;张严峻;欧会林 申请(专利权)人: 浙江大学
主分类号: C12N7/00 分类号: C12N7/00;C12N5/071
代理公司: 杭州求是专利事务所有限公司 33200 代理人: 林松海
地址: 310058 浙江*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 生物反应器 扩增 流感病毒 h1n1 优化 工艺 方法
【说明书】:

发明公开了一种生物反应器扩增流感病毒H1N1的优化工艺方法。该方法用聚纤维纸片(Fibra disk)载体和生物反应器系统扩增犬肾上皮细胞(MDCK)从而建立流感病毒复制扩增的整套工艺流程。本发明建立在对H1N1型流感病毒复制扩增体系全面适应的条件下,在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基,在病毒接种吸附后至24小时使用带5%的血清DMEM培养基加0.5%的胰酶,在收获病毒阶段采用无血清培养基添加0.25%的水解乳蛋白和0.25%的胰酶,同时每24小时补充1.5g/L的葡萄糖,采用批式收获换液方法。该方法在优化工艺基础上使用组合培养基方案,能达到较高的病毒滴度,所建立的优化工艺是具有良好重复性、高效流感病毒H1N1扩增的工艺。

技术领域

本发明涉及生物技术领域,特别是用于扩增流感病毒H1N1时所用到的用生物反应器扩增流感病毒H1N1的一套优化的工艺方法。

背景技术

MDCK细胞是流感病毒的包装细胞,目前的流感病毒疫苗小规模生产依旧主要以鸡胚培养的方式生产,存在工艺落后,无法进一步优化,劳动力密集,产能不足的情况。因此MDCK细胞的生物反应器大规模培养以及流感病毒H1N1大规模扩增技术具有十分重要的市场意义。

要完善流感病毒H1N1扩增工艺,首先必须对MDCK细胞生理和生长特性有全面认识,对H1N1感染细胞后的复制机理有深入了解。细胞感染病毒前后会发生多种变化,如细胞干重、蛋白和DNA含量、细胞大小都有不同程度的增加,感染的过程需要更多的能量。因此在培养病毒阶段更要注意营养物质的适度补给。一方面及时补充葡萄糖,因为在病毒扩增过程中,一旦葡萄糖耗竭会导致病毒扩增的停止。另一方面,根据氨基酸代谢的变化测定,适当补充最易消耗的几种氨基酸。

关于生物反应器扩增MDCK细胞和流感H1N1病毒的工艺优化已有一定研究,目前基本以悬浮培养MDCK扩增病毒的工艺为主流,同样也有以微载体Cytodex系列为生物反应器载体扩增流感病毒H1N1的研究报导,以上培养系统具有容易放大的优点,但由于悬浮培养剪切力较高,单个细胞病毒产量相对较低。

发明内容

为了克服现有技术的不足,本发明的目的是提供一种生物反应器扩增流感病毒H1N1的优化工艺方法,在Fibra disk为载体的生物反应器上最大程度优化流感病毒H1N1的生物反应器扩增工艺,从而获得高滴度的流感病毒H1N1,并且稳定可重复,适用于流感病毒H1N1疫苗的生产。

一种生物反应器扩增流感病毒H1N1的优化工艺方法,采用聚纤维纸片载体在生物反应器内扩增犬肾上皮细胞(MDCK),然后进行流感病毒复制扩增,具体如下:

在生物反应器内加入生长液,所述的生长液为含10%的胎牛血清的DMEM培养基,接种MDCK细胞,批次换液培养7天,密度达到6.0×106个/ml以上,培养细胞7天后换液成无血清培养基加0.5%的胰酶,接种流感病毒H1N1,35℃静止吸附病毒3小时,加入5%胎牛血清,继续培养21小时,弃去全部培养液,并用PBS冲洗一遍去除血清,全部换成无血清DMEM培养基加0.25%水解乳蛋白和0.25%的胰酶,静止再吸附2小时以利于病毒再感染正常细胞,同时每24小时补充2g/L的葡萄糖;

连续培养扩增病毒,每24小时批次换液,分别收获48、72、96、120小时上清;120小时后,细胞每日葡萄糖消耗低于1g/L,用低渗缓冲液破细胞,反复冲洗三次,收获细胞内病毒。

所述的生物反应器规格为5-10L,所用聚纤维纸片载体为Fibra disk,质量为150克。

所述流感病毒H1N1的接种量MOI为0.05。

所述的方法,接毒后收获方式采用批式换液收获,同时补充相同体积的维持液,所述的维持液包含DMEM、0.25%水解乳蛋白、0.25%的胰酶,收获时间点为48、72、96和120小时。

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