[发明专利]一种用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片及其制备和使用方法

说明书

本发明公开了一种用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片及其制备和使用方法，其是在固相载体表面点阵固定有十种特异性凝集素探针，通过包被十种特异性凝集素以实现人血清中十种糖链的联合检测；其中，固相载体为16‑氨基‑1‑十六烷硫醇和DOTA‑NHS‑ester化学修饰的金箔芯片，且DOTA‑NHS‑ester末端的三个羧基用EDC和NHS活化，以固定特异性凝集素为探针。本发明的芯片具有高通量、高选择性、特异性高等优点，更适应于人类肿瘤糖基谱特点的研究。

技术领域

本发明涉及一种用于检测人类血清糖链水平的凝集素芯片，属于生物技术领域。

背景技术

根据《2017年中国肿瘤登记年报》，中国每天有一万人确诊为癌症，每分钟约7人确诊患癌。预期人寿命86岁时，累积患癌风险高达36％。死亡率排前的癌症主要为肺癌和消化系统癌症。其中，胃癌的发病率和死亡率均位于中国肿瘤年报的第二位，并且胃癌已连续多年位于安徽省肿瘤发病率的第一位。虽然医疗技术、检测手段已有了很大提高，但是由于人们对放射线、胃肠镜等检查的担心和恐惧，使得肿瘤的早期检出率一直不高。同时肿瘤的生物学行为存在明显个体差异，大多数肿瘤缺乏特异的靶向治疗药物，并且没有有效地用于评估疗效的指标，这些都使得患者对肿瘤的治疗效果不满意，治疗手段发展缓慢。

生命代谢过程中，蛋白质糖链改变往往比蛋白质本身更容易受到疾病过程影响。已有报道，细胞膜糖蛋白和糖脂异常、糖基变化是肿瘤细胞显著特征之一，并与肿瘤细胞黏附、侵蚀、转移及肿瘤免疫学密切相关。随着精准医疗理念发展，肿瘤标记物筛查与应用已成为肿瘤生物学治疗重要靶标。目前已有十种糖蛋白被美国FDA批准用于临床，如HER-2、CEA、CA199、AFP和PSA等，已被广泛应用于肿瘤预防、诊断、治疗及预后判断。研究发现，哺乳动物共有十种糖链，其中人类有九种：D-glucose(D-Glc，D-葡萄糖)、D-mannose(D-Man，D-甘露糖)、D-galactose(D-Gal，D-半乳糖)、N-acetylglucosamine(N-GlcNAc，N-乙酰氨基葡萄糖)、N-acetylgalactosamine(N-GalNAc，N-乙酰半乳糖胺)、D-glucuronic acid(D-GlcA，D-葡萄糖醛酸)、L-fucose(L-Fuc，L-岩藻糖)、N-acetylneuraminic acid(Neu5Ac，N-乙酰神经氨酸)和D-xylose(D-Xyl，D-木糖)等。一些非正常修饰如岩藻糖基化、唾液酸化作用、β1,6分支N-glycans以及Tn antigen(被删减的O-glycan)与肿瘤发展密切相关。

目前已发现300余种凝集素，分别来源于细菌、病毒、植物及动物。凝集素对糖链亲和力具有个体特异性，每一种凝集素都具有针对某一种特异性糖基的专一性结合能力。因此，凝集素可作为一种探针来研究细胞膜上特定糖基。传统检测手段对于高通量蛋白质糖基化研究评价众说纷纭。基于此，凝集素芯片可作为多重分析病理学样本高通量检测平台。与以往传统方法相比，凝集素芯片具有高通量、高选择性、特异性高等优点，更适应于人类肿瘤糖基谱特点的研究。

凝集素芯片目前主要应用于胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌以及生殖医学等方面。虽然已有研究发现，胃癌患者血清LCA、ACA以及PHA-E+L结合的糖蛋白的糖链含量比正常胃以及胃炎患者明显增加，并且ACA结合的糖链分子可能与胃癌预后相关。肝癌患者血清糖蛋白岩藻糖含量明显高于正常人。但上述研究标本大多选自患者手术大体材料或体外培养细胞，因此无法进行普通人群大规模样本的高通量筛查，缺乏对肿瘤患者进展、疗效以及预后判断的有效手段。

以往糖链研究多使用商业化凝集素芯片，使用玻璃或凝胶作为包被载体，凝集素探针易于洗脱、芯片几何图片不佳、敏感性较低，尤其是患者血清糖链变化与肿瘤侵袭、转移以及与患者生存期相关性研究缺乏。因此，亟需深入研究肿瘤的糖链特点，寻找可以用于肿瘤的早期发现、治疗评价、复发或进展监控以及生存期预警的特异性糖链。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测人类普通人群及肿瘤患者血清糖链水平的组合凝集素芯片及其制备方法和使用方法。