[发明专利]一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原预包被联合检测方法及其检测试剂盒和应用

权利要求书

1.一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，用于非临床疾病诊断治疗和非健康状况判断用途，其特征在于，包括以下步骤：

S1、分别对动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒单价抗体进行制备并纯化，得动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的各型单价纯化抗体；

S2、用辣根过氧化物酶通过高碘酸钠法分别对动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的单价纯化抗体进行标记，得动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的检测用酶标抗体，制成单价酶标抗体使用液；

S3、以动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原单价纯化抗体分别进行酶标检测板的预包被处理，预包被处理中加入保护剂进行封闭保护；所述保护剂包括但不限于以下成分：BSA、明胶，血清、酪蛋白、白蛋白、海藻糖、磷酸盐、碳酸盐中的一种或多种，在载体板上标示三种不同的颜色分别对应各型脊髓灰质炎病毒D抗原，用不同颜色对加入的抗体型别进行区分，制得预包被载体，所得预包被载体能批量制作且能满足检测条件指标下实现长期存放；

S4、采用各型预包被载体捕获相应待检抗原形成抗原抗体复合物，再与同型酶标记抗体结合，通过底物催化酶显色，根据显色结果完成对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ各型D抗原的联合定性检测或定量检测。

2.根据权利要求1所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，其特征在于，

步骤S3中所述保护剂为：每1000ml保护剂包含7~13g BSA，7~13海藻糖、3~7g明胶，1~2g酪蛋白，30~70mMol磷酸盐溶液；所述预包被载体使用抽真空包装后存放。

3.根据权利要求2所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，其特征在于，纯化抗体的制备步骤包括：

1）Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原抗血清制备：将灭活脊髓灰质炎病毒分别通过10-30%蔗糖密度梯度离心4-8小时，收集D抗原层，经电镜检测确认后用于免疫血清制备；试验动物牛或兔或羊，首免，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型单价灭活病毒D抗原与福氏佐剂等量混匀，皮下注射免疫，每个型的抗原免疫1-2只动物，避免交叉，进行3次加强免疫后采血，分离血清，采用微量中和试验进行血清中和抗体滴度测定；

2）牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原单价纯化抗体制备：取蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；将抗血清与平衡液等体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，保留目的蛋白；用10倍柱体积的常规洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，脱盐后备用；用lowry法测定蛋白含量，得各型牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原纯化抗体，-20℃以下保存待用，各个型别的免疫血清分开进行纯化，不可交叉，纯化产物不可混淆。

4.根据权利要求1所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，其特征在于，所述S2步骤包括：将辣根过氧化物酶用注射用水溶解后，加入NaIO4，静置，加入乙二醇溶液，静置，再与步骤S1所得纯化抗体混合，透析过夜；加硼氢化钠，静置，加饱和硫酸铵，离心；取沉淀溶解后透析过夜；得到单价牛、兔、羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原酶标抗体，低温保存备用，标记过程各型抗体分开进行。

5.根据权利要求1所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，其特征在于，所述S3步骤包括：

1）酶标检测板包被：将纯化好的各牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的单价纯化抗体分别通过试验确认包被条件，按条件稀释抗体至0.1-15µg/ml后，50-150µl/孔加至酶标专用检测板中，2～8℃过夜，洗板；每块板每个型别加3条24孔，用不同颜色对加入的抗体型别进行区分；

2）酶标检测板封闭：以150-250µl/孔的量加入保护剂，2～8℃过夜，洗板，晾干，真空包装后冰箱保存备用。