[发明专利]一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用

说明书

本发明提供一种预包被的可进行批量生产的脊髓灰质炎病毒（Polio virus）Ⅰ型D抗原检测方法，采用牛（兔、羊）抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒D抗原纯化抗体包被微孔板，并通过保护剂对包被板和包被抗体进行保护后制备成预包被板，同时配套辣根过氧化物酶标记的牛（兔、羊）抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒酶标抗体和其他试剂。该方法（试剂）可以对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原进行特异性的定性和定量检测，对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型C抗原，Ⅱ、Ⅲ型C、D抗原和其他肠道病毒无交叉，是一种特异性高、灵敏高，使用方便、用途广泛的Ⅰ型脊髓灰质炎病毒D抗原检测法，在IPV疫苗生产检定中有较高的应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用。

背景技术

脊髓灰质炎病毒(polio virus)属于小核糖核酸病毒科、肠道病毒属，分3个血清型，其主要侵犯脊髓前角灰质区运动神经元，临床特征为弛缓性肌肉麻痹，多发生在5岁以下儿童，尤其是婴幼儿，故亦称小儿麻痹症，是WHO继天花之后要消灭的第二种传染病的主要病原体。脊髓灰质炎病毒感染后没有特效的治疗手段，只能通过疫苗进行预防，目前用于预防控制脊灰流行的疫苗有两种：脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)和灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV) ，OPV因易于接种，成本相对较低而一度被广泛使用，但在长期使用过程中发现，其可能引起脊灰疫苗相关麻痹(VAPP)病例和疫苗衍生株脊灰病毒VDPV) ，IPV则能有效避免VAPP和VDPV的发生。因此，彻底消灭脊灰病毒最终需要用IPV全部取代OPV进行预防控制。

脊髓灰质炎病毒共有3个血清型，分别为PolioⅠ型、Polio Ⅱ型和Polio Ⅲ 型，3个型别的病毒颗粒均有2种形式，分别为具有感染性的完整病毒颗粒形式的D抗原和不具有感染性的空心颗粒C抗原。C抗原通过D抗原感染细胞过程、加热、紫外线照射、碱变性、毒力降解而产生，其VP4消失而无感染性。 D抗原具有免疫原性，可诱导机体产生保护性中和抗体，从而预防脊髓灰质炎的发生，而C抗原虽有组特异性，但免疫血清尚不能中和病毒，由于D抗原含量与灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV)接种后机体产生免疫效力之间具有较好的一致性，因此，D抗原作为IPV疫苗的主要成分抗原，其含量是IPV疫苗体外效力的关键指标，对IPV疫苗生产质控具有重要意义。

D抗原检测在IPV疫苗生产、质量控制过程中时常用到，单价原液检测、半成品配制、三价半成品检测、成品检定都有涉及脊灰病毒D抗原检测的项目，由于D抗原含量是IPV疫苗质量的一个重要标准，直接影响疫苗的保护效果，因此D抗原检测方法的优劣和便捷在一定程度上可以直接影响到疫苗的生产进程和质量标准。

由于脊灰病毒抗体用于实验后发现其包被微孔板稳定性差，不能制备成预包被板成品，只能使用前包被，包被完毕需及时进行检测，否则检测结果会出现较大差异，因此目前市场上并没有商售的脊灰病毒D抗原检测试剂盒。现有的D抗原检测方法（试剂）无法批量制备，每次使用前包被导致检测周期长，至少3天才能完成一个检测，并且对检测人员的操作技能要求高，换操作人员即有可能导致人员操作偏差出现，不利于疫苗质量的稳定性。基于市场的需求和疫苗生产检定的要求，申请人研发了一种可用于Ⅰ型IPV病毒D抗原定性或定量快速检测的方法，可以进行预包被，批量生产，全部检测时间从3天缩短为3.5小时，有效提高了疫苗的检定工作效率和检测结果的稳定性。

发明内容

基于上述现有技术存在的缺陷和不足，本发明旨在提供一种脊髓灰质炎病毒（Polio virus）Ⅰ型D抗原检测方法，该方法可以对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原进行高特异性的精准定性和定量检测。本发明还提供了一种预包被的可以进行批量生产的脊髓灰质炎病毒（Polio virus）Ⅰ型D抗原检测试剂盒。

一方面，本发明提供的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原快速定性、定量检测方法，用于非临床疾病诊断治疗和非健康状况判断用途，其特征在于，包括以下步骤：

S1、对动物抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒抗体进行制备并纯化，得动物抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒D抗原的纯化抗体；