[发明专利]一种用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法

说明书

本发明公开了一种用于FISH探针标记的BAC‑DNA的快速制备方法，包括(1)裂解菌体获得澄清裂解液；(2)利用超声波进行DNA打断；(3)采用离心柱法回收纯化DNA。本发明采用超声波破碎取代了限制性内切酶的酶切步骤，省略了酶切前DNA纯化步骤，利用超声波直接将细菌澄清裂解液中超螺旋的BAC‑DNA打碎成10kb以下的双链线性DNA，再使用硅基膜柱离心法进行纯化回收，避免了传统制备工艺中多次的纯化操作造成的DNA损失，大幅减少了制备时间和成本，提高了成品DNA得率5倍以上。

技术领域

本发明涉及分子生物学体外诊断试剂，具体涉及一种用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法。

背景技术

FISH是利用荧光素标记的DNA探针来检测在细胞、组织和肿瘤的特定DNA序列的分子生物学检测技术。首先，样本DNA变性，加入特定的荧光素标记的探针与变性的样本混合进行杂交，退火得到双链DNA。探针信号能够被荧光显微镜捕获，从而定性、定量地检测目标DNA。FISH用途广泛，如应用于非整倍体，微缺失综合征以及基因重排的检测。而这些对很多遗传性疾病，如白血病、淋巴瘤、实体瘤、自闭症等发育综合征有重要的临床意义。因此，FISH是来检测或确认基因或染色体异常的分子检测技术，通常用于遗传咨询、医学和品种鉴定、DNA特定功能研究。目前比较常见的FISH探针多采用BAC-DNA，采用切口平移的方法进行探针标记。

细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)是指一种以F质粒(F-plasmid)为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb-300kb左右大小的DNA片段，属于低拷贝严谨型质粒。由于BAC分子量巨大，给提取纯化带来了诸多困难。目前比较常用的BAC提取试剂盒多采用异丙醇对裂解液中的DNA进行沉淀，此方法虽然有效的回收了BAC-DNA，但异丙醇同时沉淀了裂解液中的RNA和残留的蛋白，纯度难以达到要求，需要进一步使用RNase除去RNA；用酚氯仿或离子交换柱去除蛋白质，此过程不仅繁琐费时，更会造成DNA的损失。

柱离心纯化法是目前最常用的一种核酸纯化方式，具有操作简单、回收率高、性能稳定的特点，其中使用的核酸纯化柱采用硅基质膜为滤芯，在低PH高盐环境下特异性的与核酸结合，在高PH低盐环境下释放结合的核酸，可以仅通过简单的离心操作，快速高效的纯化DNA。虽然此方法快速简便，但市售常见的硅基膜离心柱仅能对100bp-10kb的DNA片段进行有效的回收，10kb以上的DNA片段时回收率明显降低，对30-50kb以上的片段几乎无法回收，而BAC-DNA的长度最小为150kb，无法利用此方法有效回收。

切口平移法(nick translation)法是实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。以限量的DNase I在待标记的双链DNA的每一条链上产生若干个单链缺口；再利用E.coli DNA多聚酶Ⅰ的5’-3’外切酶活性和5’-3’多聚酶活性，在缺口处的5’末端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加一个核苷酸，以修补缺口，随着缺口在DNA链上的移动，标记的核苷酸就掺入到新合成的DNA链中。虽然线状、超螺旋及带缺口的环状双链DNA均可作为缺口平移法的模板，但实际应用中为避免超螺旋结构对酶不敏感，多采用Ecor I酶对BAC-DNA进行单酶酶切，将长的超螺旋BAC-DNA处理成为小片段的双链线性DNA后再进行标记。限制性内切酶需要在特定的条件下才能进行酶切,需要将DNA进行初步纯化加入到酶切体系中,酶切过程中BAC-DNA被稀释，同时加入了酶蛋白、盐等杂质，所以酶切后需要使用DNA纯化试剂盒对DNA进行再次纯化和浓缩，又会进一步造成DNA的损失。