[发明专利]一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法

说明书

本发明涉及一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法。具体技术方案如下：将多肽链CBD固定在色谱柱填料上成为CBD色谱柱，多肽链CBD是能与钙调蛋白特异性结合的多肽；将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到带有钙调蛋白标签的HCT表达载体中，转化表达蛋白，采用超生破碎法破菌取上清，获得可溶蛋白溶液；将所得蛋白溶液用CBD色谱柱纯化；然后用疏水色谱柱进一步纯化，继而用TEV酶进行酶切；最后用Talon柱除去标签和TEV酶。该方法利用同一标签进行多步亲和层析，非常快速高效。

技术领域：

本发明涉及重组蛋白，具体为一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法。

背景技术：

钙调蛋白是真核生物细胞中的胞质溶胶蛋白，由148个氨基酸组成单条多肽，相对分子质量为16.7kDa。钙调蛋白的外形似哑铃，有两个球形的末端，中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连，每个末端有两个与Ca²⁺结合的结构域，每个结构域可以结合一个Ca²⁺，一个钙调蛋白可以结合4个Ca²⁺。钙调蛋白与Ca²⁺结合后在构型上会产生明显的变化，在每一个球形末端均会暴露出疏水表面。该疏水表面的暴露使其可以与其他蛋白疏水锚定残基或疏水色谱柱填料特异性结合，故钙调蛋白可作为蛋白纯化的标签。本发明串联使用钙调蛋白能与特定疏水锚定残基和疏水色谱柱相结合的性质。利用两种特异性结合的纯化方式进行纯化，从而的到高纯度的蛋白。Andrew J.McCluskey于2007年发表得文章曾将His标签与钙调蛋白标签融合，使用镍柱等金属离子亲和柱及疏水色谱中联合使用纯化蛋白，His标签与金属离子亲和柱的结合特异性不高，本发明设计新型CBD(能与钙调蛋白特异性结合的多肽)柱，充分利用CBD与钙调蛋白特异性结合的性质，依次使用CBD柱与疏水色谱柱，从而快速获得高纯度重组表达蛋白。

发明内容：

本发明的目的是提出一种快速高效，而且为定向克隆的基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法。具体技术方案如下：

一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，过程如下：

步骤一：将多肽链CBD固定在色谱柱填料上成为CBD色谱柱；多肽链CBD是能与钙调蛋白特异性结合的多肽；

步骤二：将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到HCT表达载体中，转化表达蛋白，采用超生破碎法破菌取上清，获得可溶蛋白溶液；

步骤三：将所得蛋白溶液用CBD色谱柱纯化；

步骤四：然后用疏水色谱柱进一步纯化，继而用TEV酶进行酶切；

步骤五：最后用Talon柱除去标签和TEV酶。

优选方案，该多肽链CBD为家兔鱼尼丁受体中能与钙调蛋白特异性结合的区域。

所述步骤二可以包括如下过程：

将HCT-GFP质粒转化到BL21(DE3)细胞中，2YT培养基(含50μg/mL卡那霉素)37℃培养到OD到达约0.6，0.4mM IPTG 30℃诱导培养6小时；离心收集250ml表达蛋白的细菌培养物，8000g离心10min；加入40ml Lysis buffer重悬，冰浴下超声破碎；40，000g离心30分钟，弃沉淀，取上清；所述Lysis buffer包括：10mM HEPES pH 7.4，250mM KCl，25mg/ml DNA酶，25mg/ml溶菌酶，1mM PMSF，5mM CaCl₂。

所述步骤三可以包括如下过程：