[发明专利]一种木霉菌高效产孢的诱变与筛选方法

权利要求书

1.一种木霉菌高效产孢的诱变与筛选方法，其特征在于，通过如下操作步骤实现：

(1)木霉菌发酵培养

选取实验室保存的木霉菌LJ245(Trichoderma harzianum LJ245)作为出发菌株，该菌株已于2012年2月14日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏号：CGMCC NO.5753，该菌株几乎不产分生孢子，将该菌株接种到马铃薯或马丁氏液体培养基中活化培养2d-6d，得到发酵液；

(2)菌悬液制备

取上述发酵液10mL于三角瓶中，并加入50颗玻璃珠，震荡10min-20min，然后用生理盐水按照1:10,1:100,1:1000比例，稀释成不同浓度，得到菌悬液；

(3)木霉菌的紫外诱变处理

取(2)中不同菌悬液，分别放到自制的紫外反应箱中，进行紫外照射诱变处理；

(4)分生孢子和厚垣孢子高产菌株筛选

取诱变后且经过暗培养后的菌株分别接种于固体培养基和液体培养基中进行培养，观察固体培养基上分生孢子产生情况，筛选出分生孢子高产菌株；统计液体培养基中厚垣孢子数量，比较分析不同诱变处理得到的菌株的产孢量，以筛选出具有高产厚垣孢子的菌株；

(5)诱变菌株遗传稳定性检测

将上述得到的分生孢子与厚垣孢子高产菌株分别接种到固体和液体培养基中，进行传代培养，并统计分生孢子与厚垣孢子的数量，得到遗传稳定性良好的诱变菌株；

(6)诱变株原有降解抗生素性能测定

菌株降解四环素类抗生素性能检测：将出发菌株与诱变菌株分别接种到四环素类抗生素为唯一碳源的液体培养基中培养，并测定抗生素降解率，获得诱变株降解抗生素性能；这里所述四环素类抗生素是指金霉素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中紫外诱变使用的孢子悬液量为2mL，置于直径为9cm的培养皿中，与紫外灯距离20cm、30cm、40cm，分别打开1-3支紫外灯，使用254nm、312nm和365nm中1个波段或多个波段组合，依次照射时间为0min、4min、8min、12min、16min、20min、24min、26min、30min，每个处理重复3次，照射后，用黑布包上取出，置于黑暗中培养1d-2d。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)中所用的自制紫外反应箱包括：(1)箱体，长宽高比例为15:13:20；(2)箱体内安置有紫外灯镇流器；(3)在箱体内安装有3个不同规格的紫外灯，可用于调节254nm、312nm和365nm三个不同的波长；(4)箱内设有可调距离的定位支架、固定座和载物托盘；(5)载物托盘高度调节旋钮；(6)紫外灯开关等；电源为220V。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中用的培养基为马铃薯或马丁氏或燕麦粉培养基，其配方分别为：马铃薯培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌20-30min，固体培养基添加琼脂10g-15g；马丁氏培养基：KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌15-20min，固体培养基添加琼脂10g-15g；燕麦粉培养基：燕麦粉20g，将其溶于1000mL蒸馏水中，115℃湿热灭菌15min-20min；固体培养基添加琼脂10g-15g。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：利用该方法能同时筛选得到厚垣孢子高产菌株和分生孢子高产菌株。

6.根据权利要求1所述的高产分生孢子菌株筛选方法，其特征在于：取不同紫外诱变处理并在黑暗静止培养1-2d的菌液，各取100-200μL，分别涂布于含100mg/L金霉素的马丁氏固体培养基上，于25-35℃遮光培养，每隔24h观测菌落形态，挑选降解金霉素透明圈大的菌落，以及分生孢子产生量多大菌落，在马铃薯或燕麦粉固体培养基上划线，置于25-35℃的恒温培养箱中，避光培养3d-7d；观察分生孢子的产生时间、产量及颜色变化等，挑选分生孢子明显且产量较高的菌株，然后用无菌生理盐水将培养基表面的分生孢子冲洗下来，收集，并于显微镜下观察计数分生孢子数量；根据统计结果，获得高产分生孢子的菌株高产菌株LJ2451，其分生孢子产量与出发菌株相比可提高100-150倍。