[发明专利]提高逆转录病毒滴度的重组质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明属于重组质粒技术领域，具体涉及一种提高逆转录病毒滴度的重组质粒及其构建方法和应用，所述重组质粒为将SV40复制起点SV40 Ori和调控元件WPRE插入到MSCV病毒表达载体中形成，SV40 Ori的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，调控元件WPRE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明制备的重组质粒可以优化MSCV逆转录病毒结构，提供较为理想的病毒浓度。

技术领域

本发明属于重组质粒技术领域，具体涉及一种提高逆转录病毒滴度的重组质粒及其构建方法和应用。

背景技术

复制缺陷性逆转录病毒(Replication-deficient retrovirus)介导的基因编辑在基础研究与临床试验中被广泛应用。特别是来源于小鼠干细胞病毒(Murine stem cellvirus，MSCV)的逆转录病毒具有感染性较强、基因表达效率高等优点，在难感染细胞基因修饰中发挥了重要作用。然而，由于质粒结构的限制，难以获得高浓度的复制缺陷性逆转录病毒用于后续研究，极大限制了该类病毒的应用。因而，通过改造复制缺陷性逆转录病毒质粒结构，提高病毒滴度对扩大逆转录病毒的使用范围至关重要。

发明内容

本发明主要提供了一种提高逆转录病毒滴度的重组质粒及其构建方法和应用，该质粒优化MSCV逆转录病毒结构，可以提供较为理想的病毒浓度。其技术方案如下：

一种重组质粒，其为将SV40复制起点SV40 Ori和调控元件WPRE插入到MSCV病毒表达载体中形成，SV40 Ori的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，调控元件WPRE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，SV40 Ori基因和WPRE基因具体插入到MSCV病毒表达载体的SalI和SapI酶切位点之间。

一种重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)扩增目的片段：分别扩增SV40 Ori、WPRE、3’-LTR基因片段；

(2)目的片段拼接：将获得的3个目的片段进行PCR拼接，得到WPRE-3’-LTR-SV40Ori拼接基因；

(3)重组质粒获得：将pMSCV质粒和拼接基因分别利用SalI和SapI酶切，利用快速连接酶将线性化的质粒与拼接基因连接，得到重组制粒。

优选的，步骤(1)中，用于扩增WPRE基因的正向引物A1为：5’-gtcgacaatcaacctctggattacaaaatttg-3’，反向引物A2为：5’-tttatcgatatcagcgctttaaatttg-3’；

用于扩增3’-LTR基因的正向引物B1为：5’-ctgatatcgataaaataaaagattttatttagtc-3’，反向引物B2为：5’-actactactgaaagacccccgctgacggg-3’；

用于扩增SV40Ori基因的正向引物C1为：5’-tctttcagtagtagttcatgtcatcttattattc-3’，反向引物C2为：5’-ggaagagcgcaaaagtctaggcctc-3’。

优选的，步骤(2)中目的片段拼接过程为，将3个目的片段及50ng DNA加至10μLPfu MasterMix中，并补加ddH₂O至20μL，按照95℃10秒，68℃10秒，72℃60秒的程序扩增10个循环，然后加入引物A1与C2各1μL，再按照上述条件扩增20个循环，即得WPRE-3’-LTR-SV40 Ori拼接基因。

一种逆转录病毒，其含有上述重组质粒。

所述重组质粒在提高逆转录病毒滴度及表达强度方面具有生物学应用。

采用上述方案，本发明具有以下优点：