[发明专利]一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法

权利要求书

1.一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：选取mDNA，并将mDNA作为合成cDNA第一链的模板，然后将mDNA储存在8-14摄氏度的无菌环境下，且储存时间为45-60min，完成后备用；

S2：将S1中处理后的mDNA在PCR引物以及寡核苷酸引物的引导下，通过逆转录酶逆转录，从而能够合成第一链cDNA，并将第一链cDNA在纯化酶的作用下进行纯化处理，以保证第一链cDNA在使用时的质量；

S3：将纯化时的第一链cDNA需要结束时，将第一链cDNA放到冰上终止反应，然后将第一链cDNA置于试管内，轻弹试管混匀,稍离心甩到管底，然后放置在预热的PCR仪上；

S4：将S3中处理后的第一链cDNA再次利用PCR引物以及锚定引物，利用改进后的Cap-trapper法在PCR仪合成并扩增第二链cDNA，在反应结束后，取适量第二链cDNA在琼脂糖电泳上检测第二链cDNA的合成效果；

S5：取3-6支0.5ml试管，标号后按下表加样，温和地混合第二链cDNA，且需避免产生气泡，稍离心使样品都沉到管底，并在14-20摄氏度的条件下进行过夜；

S6：在S5中的第二链cDNA处理完成后，分别对第二链cDNA做λ噬菌体包装反应，然后测定每个包装后文库的滴度，从上面三个连接重组反应将获得2*10⁶-5*10⁶单克隆，未扩增的第二链cDNA文库在1-4摄氏度的条件下保存12-18天，即构建完成均一化全长cDNA文库。

2.根据权利要求1所述的一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于：在S4中的在合成第二链cDNA时，需要进行三次的利用PCR仪合成并扩增第二链cDNA，以保证第二链cDNA的准确度。

3.根据权利要求1所述的一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于：在S6中，如果获得的克隆数少于2*10⁶，重复上面的连接操作，并检查样品的浓度体积以及cDNA的用量。

4.根据权利要求1所述的一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于：所述的PCR引物具体为：

引物序列P1：ACACGATGCAATGACATATG,

引物序列P2：ACTGATACGGAGACGATAGA。

5.根据权利要求1所述的一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于：所述的寡核苷酸引物具体为：

引物序列P1：ACGTATGCACTGACATATA,

引物序列P2：AGTCTACGCTGACGATAGG。

6.根据权利要求1所述的一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于：所述的锚定引物具体为：

引物序列P1：ACGTACGTACCGACTGATC,

引物序列P2：AGTCTCGGCTAACGATACG，

引物序列P3：AGCTCTAGCTCGAGTAGAG。